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Per Gewicht zum Volumen

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Gravimetrische Lösungen für die Pipettenkalibrierung

Isabelle Schrepfer (Mettler-Toledo GmbH, LHCD (Liquid Handling Calibra­tion Devices))

Labormitarbeiter wissen, dass nur bei regelmässig überpüften Pipetten Genauigkeit und Präzision gewähr­leistet sind. Doch das Überprüfen der Flüssigkeitsvolumina, speziell wenn diese sehr klein sind, birgt Risiken. Hier stellen gravimetrische Methoden zum Überprüfen und Kalibrieren von Pipetten präzise und normkonforme Lösungen dar, die sicherstellen, dass diese wichtigen Laborinstrumente immer innerhalb der Spezifi­kationen funktionieren.


Pipette spielen eine zentrale Rolle im Labor, kommen sie doch bei nahezu jeder chemischen oder biologischen Anwendung zum Einsatz. Daher ist es auch besonders ­bei Projekten mit langen und kostenintensiven Produkt­entwicklungsprozessen ratsam, die Auswirkungen der Pipettenpräzision auf die Qualitätssicherung zu berücksichtigen.

Regelmäßige Überprüfung

Jede Pipette ist einzigartig und hat ihre eigene Mess­ungenauigkeit. Das Überprüfen und Kalibrieren von Pipetten soll sicherstellen, dass das abgegebene Volumen innerhalb der spezifischen Prozesstoleranzen liegt. Nur bei regelmässiger Überprüfung können sich Firmen darauf verlassen, dass ihre Pipetten innerhalb
der Toleranzen liegen. Diese Tests müssen nachvollziehbar, also speziell auch gegenüber Auditoren lückenlos dokumentierbar sein. Ohne diese regelmässigen Über­prüfungen wird es sehr aufwändig, beispielsweise nachträglich festzustellen, seit wann Pipetten nicht ­mehr im Toleranzbereich liegen. Jeder Labormitarbeiter weiss, wie mühsam und kostspielig spätere Wieder­holungen und Korrekturen sind.

Genaue Voluminabestimmung durch Wägen

Es gibt kein unabhängiges Standardreferenzvolumen. Der Liter ist offiziell als Kubikdezimeter definiert und basiert so auf Länge anstatt auf Volumen. Das Volumen einer Flüssigkeit ist abhängig von Temperatur und Druck. Dies macht es extrem schwierig, einen Standard zu definieren, der direkt auf dem Volumen basiert. Im Gegensatz dazu unterliegt das Gewicht an sich nicht diesen Einflüssen, nur die Wägeinstrumente zu dessen Bestimmung müssen in Anpassung an die Umgebungs­einflüsse kalibriert werden. Geringe Volumen, von beispielsweise nur 1 μl sind nur sehr schwer präzise bestimmbar. Auch die Verdunstung von Testflüssigkeit hat Einfluss auf das Messergebnis. Daher ist eine indirekte Methode zur Bestimmung des Volumens erforderlich.
Die traditionelle Methode zur Volumenbestimmung ist die Gravimetrie. Viele Regulierungen sind eingeführt worden, um die gravimetrische Bestimmung zu standardisieren. Demzufolge sind korrekt justiert und kalibrierte Waagen immer auf das Referenzgewicht, das sogenannte Urkilogramm, rückführbar. Eine korrekt justierte Waage gleicht die Einflüsse von Temperatur oder Luftdruck aus. Diese Einflüsse wirken sich nicht auf das Gewicht der Testflüssigkeit aus, können aber das Volumen ändern. Die Messungenauigkeit einer Waage lässt sich ebenfalls durch standardisierte Verfahren bestimmen, so dass ein Volumen mit höchst möglicher Genauigkeit errechnet werden kann.

Pipettenkalibrierung

ISO 8655 beschreibt nicht nur die Konstruktionsanforderungen an Kolbenhubpipetten, sondern schließt auch die Überprüfung der Instrumente durch das gravimetrische Verfahren zur Bestimmung der Messungenauigkeit ein und spezifiziert die Wägegenauigkeit, die für die einzelnen Volumina benötigt wird. Die Testflüssigkeit wird direkt von der Pipette in ein Gefäss dispensiert. Das Volumen der Flüssigkeit wird berechnet, indem ein Korrekturfaktor ­auf das Gewicht angewendet wird, der die Einflüsse von Flüssigkeitsdichte, Temperatur und Luftdruck kompensiert. Typischerweise wird ein Mittelwert aus ­zehn Messungen ermittelt. Die Standard­abweichung oder Verteilung der Ergebnisse ist ein Maß für die Wieder­holbarkeit oder Unsicherheit der mit der Pipette ­erzielten Ergebnisse.

Um so kleine Volumina wie 1µl gravimetrisch bestimmen zu können, sieht die ISO-Norm die Verwendung einer Mikrowaage vor, damit die notwendigen Toleranzbestimmungen eingehalten werden. Die Mettler-Toledo AG bietet mit der XP26PC eine Mikrowaage, die speziell für die Kalibrierung von Mikropipetten konstruiert wurde und für die Bestimmung von Gewichten im Mikrobereich geeignet ist. Eine integrierte Verdunstungsfalle minimiert die Verdunstung der dispensierten Testflüssigkeit. So wird ein genaueres Messergebnis sichergestellt und die Stabilisierungszeit verkürzt. Der Deckel der Verdunstungsfalle öffnet sich automatisch, wenn die Pipette die integrierte Lichtschranke passiert. Das sorgt für einen ergonomischen Handhabungsprozess und minimiert die Benutzerermüdung bei monotonen Arbeitsvorgängen.

Vom Gewicht zum Volumen

Durch die oftmals hohe Anzahl der auszuführenden Pipettenprüfungen, lassen sich die Volumina am leichtesten via einer Software errechnen. Mit Calibry bietet die Mettler-Toledo AG eine Pipettenkalibriersoftware, die ­den gesamten Kalibrierprozess mit vollständiger Benutzerführung und umfassender Pipettenmanagement-Funktio­na­lität unterstützt und die Konformität mit ISO 8655 sicherstellt. Calibry rechnet automatisch Gewicht in Volumen um und überträgt auch die Werte für Mess­unsicherheit auf das Volumen.

Die Software speichert alle Daten in einer sicheren Datenbank und erleichtert es den Anwendern die FDA-Vorschrift 21 CFR Part 11 zu erfüllen, die die komplette Aufzeichnung der Daten fordert. Der gesamte Verlauf der zurückliegenden Kalibrierungen einzelner Pipetten ist somit leicht zugänglich und jederzeit nachvollziehbar.

Die neueste Version der Calibry Software unterstützt erstmalig RFID-fähige Pipetten, wie beispielsweise die Rainin Pipetten aus der Pipet-Lite XLS Serie. Calibry liest via RFID-Lesergerät Informationen wie Seriennummer, Projektname oder Rekalibrierdatum von den Pipetten-Tags und schreibt neue Informationen auf die Tags. ­RFID-fähige Pipetten und eine RFID-fähige Kalibrier­software stellen einen großen Fortschritt für die Überwachung von Pipetten dar und geben Firmen ein erhöhtes Maß an Sicherheit bei den täglichen Routinevorgängen.

Erstveröffentlichung: Schrepfer, I., q&more, 2.2011.

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