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Wirkstoffsuche im Genom von Pilzen

Bioinformatische Identifikation von essenziellen Genen ermöglicht effizientes Stammdesign

Dr. Christian Derntl (Technische Universität Wien, Institut für Verfahrenstechnik, Umwelttechnik und Technische Biowissenschaften)

In Pilzen schlummert ein riesiges Potenzial für neue Wirkstoffe und wertvolle Substanzen, wie etwa Antibiotika, Pigmente und Rohstoffe für biologische Kunststoffe. Herkömmliche Methoden zur Entdeckung dieser Verbindungen stoßen zurzeit leider an ihre Grenzen. Neueste Entwicklungen auf den Gebieten der Bioinformatik und der Biotechnologie eröffnen jedoch neue Ansätze und versprechen die Entdeckung neuer Substanzen.

Pilze als Lieferanten für wertvolle Substanzen

Das Reich der Pilze umfasst Millionen von Arten mit verschiedensten Eigenschaften und Ausprägungsformen. So gehören essbare Waldpilze und Bäckerhefe genauso zu den Pilzen, wie bestimmte Einzeller, die in großer Anzahl in den Meeren zu finden sind [1]. Eine wichtige Gemeinsamkeit aller Pilze ist, trotz ihrer Unterschiede, die Produktion von sogenannten Sekundärmetabolite. Das sind chemische Verbindungen, die den Pilzen gewisse Überlebensvorteile verschaffen, jedoch auch von uns Menschen als Wirkstoffe und Pharmazeutika verwendet werden können [2]. So wäre unsere moderne Gesellschaft etwa ohne die Entdeckung von Penicillin kaum vorstellbar. Andere Sekundärmetaboliten aus Pilzen werden als Medikamente in der Krebstherapie oder gegen hohe Cholesterinwerte verwendet, oder können als Farbstoffe oder als Grundchemikalien für biologische Kunststoffe zum Einsatz kommen [3,4].

Der Sekundärmetabolismus ist höchst divers

Sekundärmetaboliten aus Pilzen entstammen deren Sekundärmetabolismus. Dies sind verschiedene Stoffwechselwege, deren Produkte für das normale Wachstum nicht notwendig sind. Im Gegensatz dazu ist der primäre Metabolismus die Grundlage des Lebens – er ist in allen Lebensformen, auch über das Reich der Pilze hinweg, sehr ähnlich. Die Evolution kann hier nur langsam und bedächtig fortschreiten, weil jegliche Veränderung große Auswirkungen auf das gesamte System hat. Im Sekundärmetabolismus hingegen konnte die Natur sich austoben und experimentieren [5]. Dadurch ist es über die Jahrmillionen zu einer erstaunlich großen Vielfalt an Sekundärmetaboliten in Bezug auf ihre chemische Struktur und Wirkung gekommen [6]. Wir beobachten heute eine hohe Variabilität bei verschiedenen Pilzarten. Je nach Lebensraum und Lebensart der verschiedenen Arten konnte sich der Sekundärmetabolismus evolutionär unterschiedlich entwickeln. Diese Vielfalt verspricht die Entdeckung vieler neuer wertvoller Substanzen [3].

Schrittweise Biosynthese von Sekundärmetaboliten

Abb. 1 Der Weg vom Gen zum fertigen Sekundärmetaboliten. Sekundärmetabolite werden schrittweise in Enzymkaskaden gebildet (A). Die zugehörigen Gene finden sich oft in sogenannten „Biosynthetic gene clusters“ (B). Zwischen den essenziellen Genen (farbig) liegen oft sogenannte „gap genes“ (grau), die nicht an der Biosynthese beteiligt sind. PKS, Polyketid-Synthase; NRPS, nichtribosomalen Peptidsynthetase.

Wichtig sei zu erwähnen, dass Sekundärmetaboliten trotz ihrer großen Vielfalt in ein paar grundlegende Gruppen eingeteilt werden können. Diese Einteilung basiert auf der Art und Weise, wie ein Sekundärmetabolit synthetisiert wird.

Um die zwei wichtigsten Gruppen in Pilzen zu nennen, Polyketide werden aus Acetyl- und Malonyl-Untereinheiten gebildet und nichtribosomale Peptide aus verschiedenen Aminosäuren [2]. In beiden Fällen wird zunächst das chemische Grundgerüst der Sekundärmetaboliten an speziellen Enzymkomplexen (Polyketid-Synthasen beziehungsweise nichtribosomalen Peptidsynthetasen) gebildet (Abb. 1A). In Folge modifizieren weitere Enzyme das Grundgerüst schrittweise in einer Enzymkaskade bis schließlich der finale Sekundärmetabolit entsteht (Abb. 1A). Die Gene, die für die aufeinanderfolgenden Enzyme kodieren, befinden sich bei Pilzen oft in direkter Nähe zueinander auf der DNA, in sogenannten „biosynthetic gene cluster“ (BGC; dt. biosynthetische Gen-Anhäufung) (Abb. 1B) [2].

Klassische Methoden zur Entdeckung von Wirkstoffen

Abb. 2 Vergleich herkömmlicher und reverser Strategie für die Entdeckung neuer Sekundärmetabolite. FunOrder liefert wichtige Informationen für die BGC-Aktivierung in der reversen Strategie.

Die herkömmliche Methode zur Identifikation von Sekundärmetaboliten aus Pilzen (Abb. 2) zeichnet sich durch einen hohen Material- und Personaleinsatz aus. Hierzu muss zunächst erwähnt werden, dass die meisten BGC unter Standardbedingungen nicht aktiv sind. Das heißt, der Pilz produziert die zugehörigen Sekundärmetaboliten im Labor nicht – schlicht und einfach, weil er sie nicht braucht. Um nun neue Sekundärmetabolite zu finden, muss man einen Pilz zunächst zur Biosynthese der Sekundärmetabolite zwingen. Dafür wird der Pilz auf verschiedenen Nährmedien, gemeinsam mit anderen Organismen oder unter gewissen Stressbedingungen kultiviert. Diese ungerichteten Bemühungen sind allerdings oft nicht von Erfolg gekrönt, und eine Vielzahl der BGCs in einem Pilz bleiben inaktiv [7,8].

Anschließend an die zahlreichen Kultivierungen kann auf bestimmte Bioaktivitäten, wie etwa antibakterielle Wirkung, getestet werden. Alternativ beziehungsweise ergänzend dazu wird mittels verschiedener analytischer Methoden nach neuen Substanzen gesucht und diese charakterisiert. Abschließend muss dann ein Wirkstoff einem BGC zugeordnet werden, da die BGC-Aktivierung in diesem Ansatz eben nicht zielgerichtet geschieht. Diese Zuordnung ist wiederum ein aufwändiger, teils mehrjähriger Prozess, auf den hier nicht im Detail eingegangen wird.

Neue Ansätze: vom Gen zum Produkt

Auf Grund der Limitierungen der klassischen Methode wird in der letzten Zeit vermehrt auf eine reverse Strategie (Abb. 2) gesetzt [3,8]. Hier geht man von einem BGC aus und aktiviert diesen durch gezielte genetische Manipulationen beziehungsweise transferiert die Gene in einen anderen Organismus. Durch ein geschicktes Design dieser genetischen Manipulationen kann kontrolliert werden, unter welchen Bedingungen der BGC aktiv ist – es genügt daher eine einfache Kultivierung. Abschließend wird, wie bei der klassischen Methode, auf Bioaktivität getestet und die neue Substanz chemisch analysiert und charakterisiert. Dieser Ansatz erspart die zahlreichen Kultivierungen und die nachträgliche Zuordnung von einem Sekundärmetaboliten zu einem BGC, weil hier eben von den Genen ausgegangen wird. Diese Strategie ermöglicht es auch BGCs zu aktivieren, die durch herkömmliche Methoden nicht aktiviert werden konnten. Die reverse Strategie ist jedoch auf das Vorhandsein von Genomsequenzen und eine korrekte Vorhersage der BGCs angewiesen [4].

Die Frage nach den essenziellen Genen in einem BGC

Fortschritte auf dem Gebiet der Sequenzierungstechnologie haben in den letzten Jahren zu einer explosionsartigen Vermehrung von verfügbaren Genomsequenzen geführt. Es gibt zudem eine Reihe von bioinformatischen Tools, die BGCs vorhersagen können [9]. Aber auch nach erfolgreicher Identifikation eines BGCs, bleibt ein großer Stolperstein für die reverse Strategie. Es gibt nämlich in vielen BGCs sogenannte „gap genes“ (dt. Lückengene) (Abb. 1B). Das sind Gene, die rein zufällig in den BGCs liegen, obwohl sie nichts mit der Biosynthese des zugehörigen Sekundärmetaboliten zu tun haben. Für eine effiziente und erfolgreiche reverse Strategie ist es notwendig, nur jene Gene zu aktivieren, die auch tatsächlich an der Biosynthese beteiligt sind – die sogenannten essenziellen Gene. Bisherige Tools haben sich eher auf die prinzipielle Vorhersage von BGCs konzentriert und die Trennung von essenziellen Genen und „gap genes“ einer zeitaufwändigen manuellen Auswertung und Interpretation überlassen. Mit FunOrder haben wir eine Methode entwickelt, die bei der Identifizierung der essenziellen Gene unterstützt [10].

FunOrder identifiziert essenzielle Gene über Koevolution

Abb. 3 Übersicht über den Ablauf der FunOrder-Methode

Wie zuvor erwähnt, läuft die Evolution im Sekundärmetabolismus schneller ab als im Rest eines Genoms. Wir können zudem davon ausgehen, dass die Evolution der einzelnen Gene innerhalb eines BGCs etwa gleich schnell und in die gleiche Richtung abläuft, da die resultierenden Enzyme im Biosyntheseweg auf aufeinander abgestimmt sein müssen (Abb. 1A) – wir sprechen hier von Koevolution. Basierend auf dieser Annahme haben wir mit „FunOrder“ eine bioinformatische Methode entwickelt, die Koevolution berechnet (Abb. 3) [10].

Dafür werden zunächst die Sequenzen aller Gene eines BGCs mit einer experimentell optimierten Datenbank verglichen. Basierend auf einem Sequenz-Abgleich mit den nächsten Verwandten wird für jedes Gen ein phylogenetischer Baum erstellt. Die Bäume der einzelnen Gene werden anschließend verglichen und evolutionäre Abstände berechnet. Anders ausgedrückt, die Methode berechnet, wie sehr sich die evolutionären Werdegänge der einzelnen Gene untereinander ähneln. Im letzten Schritt werden die evolutionären Abstände auf verschiedene Arten visualisiert, und manuell interpretiert.

Fazit / Ausblick

Die FunOrder-Methode ermöglicht es Koevolution von verschiedenen Genen zu berechnen und so essenzielle Gene in einem BGC zu identifizieren. Diese Methode erleichtert damit das Design von reversen Strategien und ermöglicht so die Entdeckung von neuen Sekundärmetaboliten und damit potenziellen neuen Wirkstoffen. Aktuell arbeiten wir an einer vollständigen Automatisierung dieser Methode, um den Ablauf weiter zu beschleunigen und damit die zu erwartende Fülle an zukünftigen Genomsequenzen entsprechend auswerten zu können.

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Kategorie: Molekulare Biotechnologie | Drug Discovery

Literatur:
[1] Hawksworth DL, Lücking R. Fungal Diversity Revisited: 2.2 to 3.8 Million Species. Microbiol Spectr, 2017;5(4). DOI: 10.1128/microbiolspec.FUNK-0052-2016
[2] Keller NP, Turner G, Bennett JW. Fungal secondary metabolism – from biochemistry to genomics. Nat Rev Microbiol. 2005;3(12):937-947. DOI: 10.1038/nrmicro1286
[3] Brakhage AA, Schroeckh V. Fungal secondary metabolites – strategies to activate silent gene clusters. Fungal Genet Biol. 2011;48(1):15-22. DOI: 10.1016/j.fgb.2010.04.004
[4] Alberti F, Foster GD, Bailey AM. Natural products from filamentous fungi and production by heterologous expression. Appl Microbiol Biotechnol. 2017;101(2):493-500. DOI: 10.1007/s00253-016-8034-2
[5] Lind AL, Wisecaver JH, Lameiras C, Wiemann P et al. Drivers of genetic diversity in secondary metabolic gene clusters within a fungal species. PLoS Biol. 2017 Nov 17;15(11):e2003583. DOI: 10.1371/journal.pbio.2003583
[6] Rokas A, Mead ME, Steenwyk JL, Raja HA, Oberlies NH. Biosynthetic gene clusters and the evolution of fungal chemodiversity. Nat Prod Rep. 2020 Jul 1;37(7):868-878. DOI: 10.1039/c9np00045c
[7] Soldatou S, Eldjarn GH, Huerta-Uribe A, Rogers S, Duncan KR. Linking biosynthetic and chemical space to accelerate microbial secondary metabolite discovery. FEMS Microbiol Lett. 2019 Jul 1;366(13):fnz142. DOI: 10.1093/femsle/fnz142
[8] Wiemann P, Keller NP. Strategies for mining fungal natural products. J Ind Microbiol Biotechnol. 2014;41(2):301-13. DOI: 10.1007/s10295-013-1366-3
[9] Medema MH. The year 2020 in natural product bioinformatics: an overview of the latest tools and databases. Nat Prod Rep. 2021;38(2):301-306. DOI: 10.1039/d0np00090f
[10] Vignolle GA, Schaffer D, Zehetner L, Mach RL et al. FunOrder: A robust and semi-automated method for the identification of essential biosynthetic genes through computational molecular co-evolution. PLoS Comput Biol. 2021 Sep 27;17(9):e1009372. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1009372

Publikationsdatum: 21.12.2021

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