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Die Zelle ist die zentrale Einheit des menschlichen Körpers – der Schlüssel zum Verständnis der Biologie der Gesundheit und der Art und Weise, wie molekulare Dysfunktion zu Krankheiten führt. Dennoch ist unser Verständnis der Hunderte existierender Zelltypen und -subtypen im menschlichen Körper noch begrenzt und basiert teilweise auf Techniken mit zu geringer Auflösung. Verfahren zur Klassifizierung wurden größtenteils auf Ensembles vieler Zelltypen gleichzeitig angewandt – wodurch kritische Unterschiede zwischen den Zellen verdeckt wurden.

Um dieser grundlegenden Wissenslücke zu begegnen, wurde vor einigen Jahren das Human Cell Atlas Project (https://www.humancellatlas.org/), ähnlich dem Human Genome Project, auf den Weg gebracht. Zur Bearbeitung dieses Projekts hat sich eine internationale Gemeinschaft von Biologen, Klinikern, Technologen, Physikern, Computerwissenschaftlern, Softwareingenieuren und Mathematikern zusammengeschlossen. Diese Gemeinschaft von Wissenschaftlern mit unterschiedlichem Fachwissen hat das gemeinsame Ziel, eine umfassende Referenzkarte aller menschlichen Zellen als Grundlage für das Verständnis der menschlichen Gesundheit und der Diagnose, Überwachung und Behandlung von Krankheiten zu erstellen [1]. Ohne eine solche Karte der verschiedenen Zelltypen, ihrer Position im Körper und der Gene, die sie exprimieren, können nicht alle zellulären Aktivitäten verstanden und die ihnen zugrunde liegenden biologischen Netzwerke beschrieben werden [2]. In jüngster Zeit haben neue Werkzeuge wie die Einzelzellgenomik und die Omics-Technologien dieses Ziel zum ersten Mal in greifbare Nähe gerückt.

Einzelzellen im Fokus moderner Analysetechnologien

© Fraunhofer IPA

Abb. 1 A) Partiell dissoziiertes Lebergewebe; B) Mit dem TissueGrinder dissoziierte Hepatozyten aus Lebergewebe

Die überwiegende Mehrheit dieser Technologien benötigt für den Analyseprozess zunächst Einzelzellen, also Zellen, die aus einem Gewebeverbund möglichst schonend herausgelöst sind (Abb. 1). Entscheidende Voraussetzung für die Analytik ist daher die effiziente Bereitstellung von qualitativ hochwertigen Einzelzellen aus Gewebeproben (Abb. 2). Hier spielen nicht nur der Aufwand, die Lebensfähigkeit und Zellausbeute, sondern insbesondere auch der Erhalt der Zellvielfalt und Funktion eine wichtige Rolle. Viele präanalytische Variablen können die Genauigkeit und Zuverlässigkeit von Einzelzellanalysen beeinflussen. Die Standardisierung der präanalytischen Variablen wird jedoch durch die Vielzahl der manuellen Methoden zur Probengewinnung und -verarbeitung erschwert. Einflussfaktoren auf dem gesamten Weg des Gewebes zur Einzelzelle, einschließlich Probenerfassung, Probentransport sowie die Verarbeitung nach der Dissoziation, wie z.B. die Nukleinsäureextraktion, die Bibliotheksvorbereitung und die Wahl der Sequenzierungsmethoden, sind entscheidend für die Zuverlässigkeit von Einzelzellanalysen [3].

Gewebedissoziationsmöglichkeiten

Abb. 2 Gewebedissoziation – Bottleneck der Gewebereise

Es überrascht nicht, dass ein so komplexes System wie der menschliche Organismus Gewebetypen umfasst, die ein bemerkenswertes Spektrum an Steifigkeit abdecken; die Elastizitätsmodule reichen von den 11 Pa des Darmschleims bis zu den 70 kPa von vorverkalkten Knochenzellen, was ungefähr der Steifigkeit eines Gummibärchens entspricht [4]. Zwischen diesen Extremen sind fast alle Größenordnungen durch ein entsprechendes Gewebe vertreten. Die Nervengewebe gehören zu den weichsten des menschlichen Körpers, was angesichts ihres anatomischen Schutzes und der Tatsache, wie leicht sie beschädigt werden können, zu erwarten ist. Es folgen die meisten Bauchorgane (wie z.B. Bauchspeicheldrüse, Milz und Leber), Muskeln und schließlich stützende Strukturen wie Knorpel, Sehnen, Bänder und schließlich Knochen [5].

courtesy of Camin Dean, Charité Berlin

Abb. 3 Mit dem TissueGrinder dissoziierte Zellen aus dem Cortex und Hippocampus von adulten Mäusen (grün: Neuronen, rot: Astrozyten, blau: Zellkern)

Diese vielfältigen Probeneigenschaften machen eine standardisierte und automatisierte Gewebeverarbeitung schwierig. Die Zerlegung eines Organs oder Gewebes in eine Einzelzellsuspension, um eine Einzelzellanalyse zu ermöglichen, kann ein langwieriger und anspruchsvoller Prozess sein. Unterschiedliche Gewebe erfordern unterschiedliche Dissoziationsprotokolle. Es gibt keine allgemeingültige Lösung. Im Allgemeinen lassen sich embryonale Gewebe leicht dissoziieren, während adulte Gewebe (Abb. 3) eine größere Herausforderung darstellen. Krankes und fibrotisches Gewebe kann besonders schwierig zu dissoziieren sein [6]. Der Großteil der Gewebedissoziation wird immer noch manuell mit Skalpell, Enzymverdau und Zellstrainern durchgeführt. Auch erste automatisierte Ansätze setzen auf die vorherige Behandlung mit Enzymen. Dadurch können sich die Morphologie und die Oberflächenmarker der Zellen verändern, was ihr diagnostisches Potenzial drastisch verringert. Die von Fraunhofer entwickelte enzymfreie und schnelle TissueGrinder-Technologie überwindet diesen grundsätzlichen Bottleneck in der Prozesskette und ermöglicht es, das diagnostische Potenzial neuer Technologien zu entfalten (Abb. 4).

© Fraunhofer IPA

Abb. 4 TissueGrinder Fraunhofer IPA. Die TissueGrinder-Technologie ermöglicht eine standardisierte Probenaufbereitung und anschließende Filtration in einem geschlossenen sterilen System auf Basis von Standard-Laborgeräten.

Durch dieses – mittlerweile an die Fast Forward Discoveries GmbH auslizensierte – Verfahren gelingt eine rein mechanische Dissoziation von Gewebeproben durch eine angepasste Geometrie des Mahlwerks, in der Schneid- und Scherkräfte abwechselnd kombiniert werden. Diese Technologie versetzt den Anwender in die Lage, innerhalb weniger Minuten weitgehend unverfälschte und qualitativ hochwertige Einzelzellen ohne den Einsatz von Enzymen aus Gewebeproben herzustellen. Durch die Integration in gängige Laborformate kann eine solche Dissoziation gut in bestehende Prozesse integriert und auch mit einer optionalen enzymatischen Vorbehandlung kombiniert werden.

Anwendungsbeispiel für Einzelzellen

Die Anwendungsmöglichkeiten und analytischen Verfahren sind vielfältig. Ein prominentes Beispiel ist die Analyse von Lymphknoten, um sicherzustellen, dass ein Tumor nicht bereits gestreut hat – hier ist der Stand der Technik noch immer die visuelle Analyse histologischer Schnitte durch einen Pathologen. Dabei kann nur ein Teil des Lymphknotens betrachtet werden. Tumorzellen zwischen den Schnittebenen bleiben so unentdeckt. Die Vereinzelung des gesamten Lymphknotens erlaubt eine exakte Quantifizierung des Tumorbefalls und eine anschließende genetische Charakterisierung der Tumorzellen [7]. Der Nachweis spezifischer Mutationen ist entscheidend für die Auswahl moderner Medikamente zur personalisierten Therapie [8]. Zusätzlich kann ein hoher Durchsatz an Probenmaterial durch eine parallelisierte Gewebeaufarbeitung realisiert werden.

Ausblick

Die weiteren Schritte auf der Reise der Einzelzelle können sein: Analyse und ggf. Sortierung auf Basis von Größe, Struktur oder weiteren physikalischen Eigenschaften wie Elastizität [9] sowie spezifischen markierten Oberflächenstrukturen, genetische Sequenzierung oder eine Analyse mit Hilfe der Massenspektrometrie. Ein enormes und bisher weitgehend unerschlossenes Potenzial bieten dabei auch die in Formalin und Paraffin fixierten und konservierten Gewebeproben (FFPE) in den pathologischen Abteilungen. FFPE-Gewebe hat den Vorteil, dass die Gewebemorphologie gut erhalten ist. Der Nachteil ist die Fixierung, welche über einen längeren Zeitraum zu einer Blockade der Antigenepitope durch Quervernetzung führt. Um diese unschätzbare und zugängliche Ressource an biologischen Proben für hochauflösende Genom-Analysen verfügbar zu machen, arbeitet das Fraunhofer IPA mit klinischen Kooperationspartnern (Prof. Gaiser & Dr. Hirsch, Universitätsmedizin Mannheim) daher auch an einem Workflow zur Generierung von Einzelzellen aus FFPE-Proben.

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Kategorie: Single Cells | Gewebedissoziation

Literatur:
[1] Regev, A., Teichmann, S.A., Lander, E.S., Amit, I. et al. (2017) The Human Cell Atlas, Elife, 2017 Dec 5;6:e27041, DOI: 10.7554/eLife.27041
[2] Tong, H., Gao, S., Long, X., Xie, L. (2021) A Neural Lyapunov Approach to Transient Stability Assessment in Interconnected Microgrids, http://hdl.handle.net/10125/71020, 2021 Jan 05, DOI: 10.24251/HICSS.2021.405
[3] Ascierto, P.A., Ferrucci, P.F., Fisher, R., Del Vecchio, M. et al. (2019) Dabrafenib, trametinib and pembrolizumab or placebo in BRAF-mutant melanoma, Nat. Med., 25 (6), 941-946, DOI: 10.1038/s41591-019-0448-9
[4] Irianto, J., Pfeifer, C.R., Bennett, R.R., Xia, Y. et al. (2016) Nuclear constriction segregates mobile nuclear proteins away from chromatin, Mol Biol Cell, 27 (25), 4011-4020, Epub 2016 Oct 26, DOI: 10.1091/mbc.E16-06-0428
[5] Guimarães, C.F., Gasperini, L., Marques, A.P., Reis, R.L. (2020) The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering, Nat. Rev. Mater., 5, 351-370, DOI: 10.1038/s41578-019-0169-1
[6] Potter A.S., Steven Potter S. (2019) Dissociation of Tissues for Single-Cell Analysis; in: Vainio S. (eds) Kidney Organogenesis. Methods in Molecular Biology, vol 1926, Humana Press, New York, NY, DOI: 10.1007/978-1-4939-9021-4_5
[7] Ulmer, A., Dietz, K., Hodak, I., Polzer, B. et al. (2014) Quantitative Measurement of Melanoma Spread in Sentinel Lymph Nodes and Survival. PLoS Med 11 (2): e1001604, DOI: 10.1371/journal.pmed.1001604
[8] Dietel, M., Jöhrens, K., Laffert, M. et al. (2015) A 2015 update on predictive molecular pathology and its role in targeted cancer therapy: a review focussing on clinical relevance, Cancer Gene Ther, 22, 417–430, DOI: 10.1038/cgt.2015.39
[9] Otto, O., Rosendahl, P., Mietke, A., Golfier, S. et al. (2015) Real-time deformability cytometry: on-the-fly cell mechanical phenotyping, Nat. Methods 12 (3), 199-202, 4 p following 202, DOI: 10.1038/nmeth.3281

Publikationsdatum: 20.05.2021

Fakten, Hintergründe, Dossiers

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