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Die angeborene Immunität ist ein zentraler Bestandteil der menschlichen Immunabwehr. Mustererkennungsrezeptoren (Pattern Recognition Receptors, PRR), wie die Toll-like-Rezeptoren (TLR) spielen in diesem System eine Schlüsselrolle. Sie sind in der Natur allgegenwärtig und kommen in Pflanzen, Insekten und Wirbeltieren bis hin zum Menschen vor.
Ihre Funktion bei der Immunabwehr gegen Krankheitserreger wurde ursprünglich in Drosphila identifiziert [1]. Heute sind sie als Immunrezeptoren mit vielen Funktionen anerkannt, wie für die Erkennung von Krankheitserregern, beschädigter körpereigener Zellen, bis hin zu Funktionen bei der Elimination von Krebszellen. Eine Fehlregulation der angeborenen Immunität kann aber auch schwerwiegende Folgen für die Betroffenen haben. Dies ist z.B. bei Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoider Arthritis, Psoriasis oder entzündlicher Darmerkrankungen der Fall. Aufgrund der entscheidenden Rolle der TLRs bei der Abwehr von Krankheitserregern und bei Entzündungsprozessen wurden sie als Wirkstofftargets für verschiedene Indikationen identifiziert, mit dem Ziel neue Antiinfektiva, Adjuvantien oder Tumortherapeutika zu entwickeln [2].
Ein grundlegendes Problem bei der Entwicklung von Immunmodulatoren als Therapeutika ist die Unterschiedlichkeit unseres Immunsystem gegenüber den in der Arzneimittelforschung üblichen Tiermodellen. Diese Unterschiede führen zu begrenzten Erfolgsraten in klinischen Studien und können im schlimmsten Fall negative Auswirkungen für die Probanden haben. Die Entwicklung von mehr als der Hälfte aller Therapeutikakandidaten, die für klinischen Studien zugelassen werden, wird bereits innerhalb der ersten zwei klinischen Phasen abgebrochen. Davon scheitern fast 60 % an mangelnder Wirksamkeit und ca. 20 % an Nebenwirkungen [3,4]. Daher gibt es vermehrt Anstrengungen, Modelle basierend auf humanen In-vitro-/Ex-vivo-Systemen zu entwickeln, welche die Reaktionen des menschlichen Immunsystems auf neue Medikamente besser abbilden können als die heute genutzten Tiermodelle.
Abb. 1 Aufbau des immunresponsiven Hautmodells: Das Hautmodell besteht aus drei Schichten, die eine getrennte Analyse jeder Schicht und damit jedes eingebrachten Zelltyps erlauben. Die oberste Schicht besteht aus Keratinozyten aus Biopsien oder aus immortalisierten Primärzellen (mit oder ohne Reportergen). Die mittlere Schicht besteht aus einer Collagenmatrix, in die dermalen Fibroblasten eingebettet sind, die wie die Keratinozyten aus Biopsien stammen oder aus immortalisierten Primärzellen, die Reportergene tragen können, bestehen. Damit können sowohl patientenspezifische Hautmodelle ex vivo aufgebaut werden wie auch reproduzierbar herstellbare (Reporter-)Hautmodelle für Wirkstoffscreening oder analytische Fragestellungen unter gleichbleibenden Bedingungen. Durch Zugabe von Immunzellen, die subdermal in einer weiteren Collagenmatrix integriert werden wird das Hautmodell immunresponsiv. Hierbei kann von Blut bis hin zu aufgereinigten, spezifisch aktivierten Immunzellen eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Analyse der Zell-Zell-Interaktionen realisiert werden.
Das Innovationsfeld „Zell- und Gewebetechnologien“ des Fraunhofer IGB unter der Leitung von Frau Dr. Burger-Kentischer beschäftigt sich seit vielen Jahren mit Immunrezeptoren und immunresponsiven Gewebemodellen, um Autoimmunerkrankungen des Menschen und Infektionen in vitro abbilden zu können. Durch eine Kombination aus Molekularbiologie und Zellbiologie wurden Gewebemodelle mit einer Immunantwort etabliert. Hierzu werden verschiedene Zelltypen eingesetzt, die je nach Anforderung mit einfach auslesbaren Reporterfunktionen ausgestattet sind und wie in einem Baukastensystem, zu unterschiedlichen Modellsystemen zusammengesetzt werden können. Dabei werden sowohl Primärzellen aus Biopsiematerial für die Analyse von patientenspezifischen Merkmalen wie auch immortalisierte Primärzellen eingesetzt, welche reproduzierbare Gewebemodelle, ohne Spendervariabilität gewährleisten können. Basis dieses Baukastensystems war die Etablierung von zellbasierten Reportersystemen für die Detektion von TLR-Modulatoren [5]. Diese Reportersysteme sind hochdurchsatzfähig und werden sowohl für die Detektion von Pyrogenen in der Medizintechnik und Pharmazie wie auch für das Screening nach Immunmodulatoren für die Wirkstoffidentifizierung eingesetzt [6,7].
Diese Reportersysteme wurden bereits in komplexere Testsysteme, wie 3D-Hautmodelle integriert. Diese Hautmodelle werden mit Hilfe einer Kollagenmatrix aufgebaut, in welche die Fibroblasten (mit oder ohne Reportergen) eingebettet werden. Darauf werden die Keratinozyten aufgebracht. Ein solches Reporterhautmodell kann nun reproduzierbar zur Testung z.B. von Chemikalien, Allergenen aber auch Kosmetika oder für die Wirkstoffentwicklung eingesetzt werden [Patent Burger-Kentischer EP 2795318 B1]. Mit diesem System können TLR-Rezeptor-mediierte Reaktionen mittels Reporter rasch und in höherem Durchsatz erfasst werden.
Dieses Hautmodell wurde durch Integration von Immunzellen zu einem immunresponsiven humanen Gewebemodell aufgebaut und nachfolgend als Infektionsmodell eingesetzt. Neben den Keratinozyten und dermalen Fibroblasten können Immunzellgemische oder spezifische differenzierte Immunzellpopulationen, wie bei einem Baukastensystem, subdermal integriert werden [8]. Die drei Schichten des Hautmodells sind in Abb. 1 klar voneinander unterscheidbar und können nach Beendigung des Experiments voneinander getrennt und separat untersucht werden.
Abb. 2 Molekulare Analyse: Durch die getrennte Analyse individueller Schichten des Modells können beispielsweise Transkriptomprofile der einzelnen Zelltypen in den Schichten getrennt voneinander analysiert werden und so die Interaktion der Zellen über Botenstoffe, wie Zytokinen, in Gegenwart von Wirksubstanzen oder Pathogenen analysiert werden. Damit können Wirkmechanismen neuer Wirkstoffkandidaten in Gewebemodellen unter Einbeziehung einer Immunantwort im humanen Kontext identifiziert werden.
Im immunresponsiven Hautmodell konnte ein deutlicher Schutz gegenüber Infektionen mit Candida albicans, einem pathogenen Pilz, beobachtet werden, wie dies auch bei gesunden Personen der Fall ist [9]. Der Pilz dringt in Anwesenheit von Immunzellen kaum in das Gewebemodell ein (Abb. 2). Mit Hilfe der Hochdurchsatz-Sequenziertechnologie, die im Innovationsfeld „In-vitro-Diagnostik“, unter der Leitung von Herrn Dr. Sohn etabliert ist, konnten detaillierte Analysen des Transkriptoms der einzelnen Zelltypen und des Pathogen C. albicans im Infektionsmodell durchgeführt werden (Abb. 3). Diese lieferten entscheidende Hinweise auf den Mechanismus der Pathogenabwehr. Die Datenanalyse zeigte, dass die Quelle der antimikrobiellen Aktivität in diesem System die dermalen Fibroblasten sind. Sie schütten eine Vielzahl von antimikrobiellen Peptiden und Chemokinen aus, die zu einem Stopp der Invasion von C. albicans in das Gewebe führen. Als Reaktion darauf zeigt das Transkriptionsprofil des Pathogen – nur in Anwesenheit der Immunzellen – eine starke Stressantwort. Die Immunzellen sind essenziell für die Initiierung der antimikrobiellen Aktivität der Fibroblasten. Dies wird durch die Aktivierung eines Zytokins erreicht, IL-1β, das zur Ausschüttung der antimikrobiellen Peptide notwendig ist. Wir konnten zeigen, dass TLR-Rezeptoren und ihre Signalwege für die beobachtete intrazelluläre Kommunikation essenziell sind [9].
Abb. 3 Immunresponsives Hautmodell als Infektionsmodell: Histologische Schnitte der Hautmodelle nach 24-h-Infektion mit einem klinischen Isolat von C. albicans in der Anwesenheit (rechts) und Abwesenheit (links) von Immunzellen. Die HE/PAS-Färbung zeigt C. albicans als violette Struktur. Die gestrichelte Linie zeigt die Eindringtiefe von C. albicans in das Gewebe. Ohne Immunzellen dringt das Pathogen bereits nach 24 h in deutlich größerer Menge und wesentlich tiefer in das Gewebe ein (links) als in Gegenwart der Immunzellen (rechts).
Mit diesem immunresponsiven Hautmodell konnten deshalb eine Reihe von TLR-Agonisten und -Antagonisten auf ihre Wirkung im Infektionsmodell untersucht werden. Im Rahmen des InfectERA-Projekts InnateFun wurden in einem ersten Schritt Immunmodulatoren über computerbasierte Methoden identifiziert (Hebrew University, Fraunhofer Project Center for Drug Discovery and Delivery). Diese wurden in den genannten zellbasierten Reportersystemen auf Wirksamkeit gegenüber TLR4, TLR7 und TLR9 überprüft. Eine Auswahl der in diesen Assays positiv getesteten Substanzen wurden dann direkt mit Immunzellen aus Blut und mit immunresponsiven Hautmodellen zusammengebracht. Dabei konnten für die jeweiligen Immunmodulatoren signifikante Unterschiede festgestellt werden. So zeigten die gefundenen TLR7/TLR9-Inhibitoren keine Wirkung im Hautmodell bei C. albicans-Infektion, konnten aber im Blut die Zytokinausschüttung nach Aktivierung der TLRs reduzieren. Die gefundenen TLR4-Inhibitoren erwiesen sich in Blutproben und im Infektionsmodell als aktiv. Damit konnte gezeigt werden, dass für die Aktivierung der Immunantwort der Haut auf invasive Pilzinfektionen TLR4 eine wesentliche Rolle spielt, TLR7/TLR9 hingegen nicht.
Im Mausmodell konnte durch die Projektpartner der Universitäten Wien und Leuven weitere Daten gewonnen werden. So konnte gezeigt werden, dass keine akute Toxizität bei allen untersuchten Immunmodulatoren vorliegt. Zudem wurde für einen der TLR-Modulatoren eine Verbesserung der Überlebensrate der Mäuse bei systemischen Infektionen mit C. albicans beobachtet. Damit wurde als Proof of Concept gezeigt, dass die identifizierten TLR-Modulatoren signifikanten Einfluss auf die Immunantwort bei Infektionen mit C. albicans in vitro, ex vivo und im Tiermodell haben.
3D-Gewebemodelle mit Immunkompetenz stehen noch am Anfang ihrer Entwicklung. Die Fortschritte in der Entwicklung dieser Modellsysteme ist jedoch rasant, so dass mehr und mehr zuverlässige Daten sowohl für die Identifizierung grundlegender Mechanismen einer Immunantwort wie auch für die präklinische Validierung von Wirkstoffen in humanbasierten Krankheitsmodellen zur Verfügung stehen werden. Dies kann einen wesentlichen Beitrag zur Verbesserung der Zulassungsrate bei neuen Medikamenten, wie auch deren Beschleunigung leisten.
Die Entwicklung der immunresponsiven Hautmodelle wurde durch das Förderprogramm FP7-PEOPLE-2013-ITN - Marie-Curie Action: “Initial Training Networks”, im Rahmen des Projekts ImResFun – Molecular Mechanisms of Fungal Pathogen Host Interactions (Project ID: 606786), ermöglicht (https://www.igb.fraunhofer.de/de/referenzprojekte/identifizierung-von-schutzmechanismen-der-haut-mithilfe-von-immu.html). Die Identifizierung der TLR-Modulatoren wurde durch Kooperationen im Rahmen des „Fraunhofer Project Center for Drug Discovery and Delivery at Hebrew University“ und durch eine Förderung des BMBF im Rahmen des InfectERA-Projekt „Stimulating Innate Immunity to combat fungal infections – InnateFun“ (https://www.innatefun.de/) möglich gemacht.
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Kategorie: Wirkstoffforschung | Immunmodulatoren
Literatur:
[1] Lemaitre, B. et al. (1996) The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults, Cell, 86, 973-83, DOI: 10.1016/s0092-8674(00)80172-5
[2] Anwar, M.A. et al. (2019) Recent clinical trends in Toll-like receptor targeting therapeutics, Med. Res. Rev., 39, 1053-1090, DOI: 10.1002/med.21553
[3] Hwang, T.J. et al. (2016) Failure of Investigational Drugs in Late-Stage Clinical Development and Publication of Trial Results, JAMA Intern. Med., 176, 1826-1833, DOI: 10.1001/jamainternmed.2016.6008
[4] Waring, M.J. et al. (2015) An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies, Nat. Rev. Drug Discov., 14, 475-86, DOI: 10.1038/nrd4609
[5] Burger-Kentischer, A. et al. (2010) A new cell-based innate immune receptor assay for the examination of receptor activity, ligand specificity, signalling pathways and the detection of pyrogens, J. Immunol. Methods, 358(1-2): p. 93-103, DOI: 10.1016/j.jim.2010.03.020
[6] Michaeli, A. et al. (2018) Computationally Designed Bispecific MD2/CD14 Binding Peptides Show TLR4 Agonist Activity, J. Immunol., 201, 3383-3391, DOI: 10.4049/jimmunol.1800380
[7] Zatsepin, M. et al. (2016) Computational Discovery and Experimental Confirmation of TLR9 Receptor Antagonist Leads, J. Chem. Inf. Model., 56, 1835-46, DOI: 10.1021/acs.jcim.6b00070
[8] Kuhbacher, A. et al. (2017) Immune Cell-Supplemented Human Skin Model for Studying Fungal Infections, Methods Mol. Biol., 1508, 439-449, DOI: 10.1007/978-1-4939-6515-1_25
[9] Kuhbacher, A. et al. (2017) Central Role for Dermal Fibroblasts in Skin Model Protection against Candida albicans, J Infect Dis., 215, 1742-1752, DOI: 10.1093/infdis/jix153
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