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Synthetische Rezeptoren für Viren

Oberflächengeprägte Hybridmaterialien für den selektiven Nachweis von Viren

Dr. Mehmet Dinc (Hahn-Schickard), Prof. Dr. Boris Mizaikoff (Universität Ulm, Institut für Analytische und Bioanalytische Chemie)

Durch die Fortschritte in der Polymerchemie und Nanotechnologie können Nanomaterialien heute mit einer Vielzahl an Eigenschaften und Funktionalitäten synthetisch hergestellt werden. Dies motiviert die Herstellung bioinspirierter Strukturen und Systeme, die beispielsweise in ihren Bindungseigenschaften den molekularen Erkennungsprinzipien biologischer Systeme folgen. Die Vielfalt an Synthesemöglichkeiten hat maßgeblich die Entwicklung von molekular geprägten Polymeren (engl. molecularly imprinted polymers, MIPs) gefördert, die häufig als „synthetische Rezeptoren“ oder „biomimetische Erkennungsmaterialien“ bezeichnet werden. Ursprünglich für niedermolekulare Templates konzipiert, konnte das Konzept des molekularen Prägens zunächst auf Biomakromoleküle und nunmehr auf ganze Zellen, Bakterien und Viren erweitert werden.

In den Bereichen Pharma, Medizin, Umwelt und Lebensmittel wächst der Bedarf an der effizienten und selektiven Erkennung von Zielsubstanzen aus komplexen Gemischen. Diese kann zur vereinfachten Isolation und/oder Aufreinigung aus komplexen Gemischen, zur Aufkonzentrierung, um die Analyse zu erleichtern oder zur Abreicherung und Entfernung von Störstoffen dienen. In der Regel erfolgen die entsprechenden Prozesse über mehrere, zeit- und kostenintensive Schritte unter Nutzung unterschiedlicher chromatographischer Verfahren bzw. Festphasenextraktionen. Zur Aufreinigung und Abtrennung von Biomakromolekülen (z.B. Proteine, DNA, etc.) bis hin zu ganzen Viren (z.B. in deren biotechnologischer Herstellung) werden häufig immobilisierte Antikörper, Antigene, Enzyme oder Aptamere als selektive Erkennungselemente eingesetzt. Auch in der serologischen Diagnostik basieren sogenannte ELISA-Tests (engl. enzyme-linked immunosorbent assays) auf natürlichen Rezeptoren und deren Wechselwirkung mit den Zielsubstanzen. Obwohl diese eine außergewöhnliche Selektivität bieten, sind insbesondere die biologischen Erkennungselemente häufig nur limitiert verfügbar, schwierig herzustellen, teuer oder in realen Anwendungsszenarien zum Teil nur begrenzt stabil. Darüber hinaus gibt es für viele wichtige Analyten keine geeigneten natürlichen Rezeptoren. Eine effektive und rasche Erkennung, Aufreinigung oder Abtrennung würden einen wesentlichen Beitrag z.B. zur Senkung der Kosten in der Produktion von biologischen Spezies leisten. Molekulare geprägte Polymere haben das Potenzial, diese essenzielle Aufgabe zu erfüllen.

Synthetische maßgeschneiderte Materialen zur molekularen Erkennung

Abb.1 Schematische Darstellung des nichtkovalenten und kovalenten Prägens anhand der Monomer-Template-Wechselwirkungen während der MIP-Synthese. Reproduktion adaptiert aus [4], mit Genehmigung von Elsevier

Die molekulare Erkennung spielt in biochemischen Prozessen eine wichtige Rolle und basiert vereinfacht auf Interaktionen zwischen komplementären Molekülen, z.B. Rezeptor-Ligand, Antikörper-Antigen, DNA-Protein, RNA-Ribosom, etc. In biologischen Systemen nutzt die molekulare Erkennung vor allem nichtkovalente Wechselwirkungen, wie beispielsweise Wasserstoffbrückenbindungen, koordinative Bindungen, hydrophobe Kräfte, π-π-Wechselwirkungen, van-der-Waals-Kräfte und elektrostatische Effekte. Die molekulare Spezifität dieser Wechselwirkungen ist für die biologische Funktion der Biomakromoleküle entscheidend [1]. Das Konzept des molekularen Prägens basiert auf der biomimetischen Nachahmung dieser Wechselwirkungen zur molekularen Erkennung, jedoch mit synthetisch maßgeschneiderten Materialien. Das Template (d.h. die Zielspezies, das Zielmolekül, ein strukturelles Analogon (engl. dummy) oder ein Epitop) wechselwirkt mit funktionellen Monomeren in einem geeigneten Lösungsmittel. Anschließend wird dieses Gemisch mit Hilfe eines Quervernetzers zu einer hochvernetzten, dreidimensionalen Matrix, die den Template-Molekül-Komplex beinhaltet, auspolymerisiert. Nach dem Entfernen des Templates erhält man in einer vereinfachten Darstellung spezifische – d.h. funktionelle wie räumliche – „chemische Abdrücke“ im Polymer, die zur Templatespezies komplementär sind und somit selektive Bindungseigenschaften aufweisen (siehe Abb. 1). In der Praxis stellen sich diese Prozesse als hochkomplex dar, und sind zum Teil noch nicht vollständig grundlegend verstanden [2-3].

Konventionell werden MIPs als Monolithe durch Block-Kopolymerisation hergestellt. Diese Technik hat verschiedene Nachteile, wie z.B. eine geringe Anzahl an oberflächennahen Bindungsstellen oder unregelmäßig geformte Partikel nach Zerkleinerung. Insbesondere die Prägung von Biomakromolekülen mit hohem Molekulargewicht (z.B. Peptide, Proteine, DNA, Viren, Bakterien, etc.) ist aufgrund der Dimensionen, der begrenzten Löslichkeit und Stabilität in den üblicherweise eingesetzten organischen Lösungsmitteln, der komplexen Struktur, des langsamen Massetransports und der strukturellen Flexibilität eine erhebliche Herausforderung.

Hybridmaterialen bieten innovative Synthese- und Anwendungsmöglichkeiten

Ausgelöst durch Fortschritte in der Polymerchemie und Nanotechnologie hat sich in den letzten Jahren vor allem das sogenannte Kern-Schale-Prägen (engl. core-shell imprinting) zu einer häufig genutzten Methode entwickelt, die für das Prägen von Biomakromolekülen besonders geeignet ist. Die prinzipielle Strategie besteht darin, Bindungsstellen an oder nahe der Oberfläche des strukturellen Kernmaterials zu erzeugen, um den ungehinderten Zugang zu den Bindungsstellen selbst für große Moleküle oder ganze Biospezies zu ermöglichen. Anorganische Kernmaterialien, wie z.B. Silikapartikel, magnetische Nanopartikel, Quantenpunkte, Goldnanopartikel, etc. sind aufgrund ihrer einstellbaren Geometrie und Oberflächeneigenschaften hierzu besonders geeignet. Diese werden im Anschluss mit einer nanodünnen, geprägten Polymerschicht überzogen. Der wesentliche Vorteil von anorganisch-organischen sogenannten Hybridmaterialien besteht darin, dass sie die gewünschten chemischen und physikalischen Eigenschaften von organischen und anorganischen Materialien in einer endgültigen Struktur vereinen und durch die Materialvielfalt innovative Synthese- und Anwendungsmöglichkeiten bieten. Die Nutzung von Silikapartikeln hat sich vor allem aufgrund ihrer chemischen Stabilität unter sauren Bedingungen, ihrer Biokompatibilität, ihrer Dispergierbarkeit in wässrigen Medien, sowie der flexiblen physikalischen und chemischen Eigenschaften zur Herstellung von molekular geprägten Hybridmaterialien durchgesetzt [4] .

Erhöhte Selektivität und Bindekapazität durch die inhibitorassistierte Synthese

Abb. 2 Inhibitorassistierte Synthese von oberflächengeprägten Hybridpartikeln für Biomakromoleküle

In Zusammenarbeit mit Labor Dr. Merk & Kollegen GmbH im Rahmen der vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Projekte PROTSCAV I&II konnte das Team um Prof. Mizaikoff am Institut für Analytische und Bioanalytische Chemie (IABC; uni-ulm.de/iabc) der Universität Ulm die sogenannte inhibitorassistierte Synthese von oberflächengeprägten Silikapartikeln zur selektiven Bindung von Proteasen etablieren [5-6]. Der Inhibitor hat die Funktion, das Templatemolekül vor dem Prägeprozess mit einer definierten Orientierung an der Oberfläche der Partikel vorab zu arrangieren, wodurch nach Entfernung des Templates homogenere Bindungsstellen an der nanodünnen Polymerschicht verbleiben (siehe Abb. 2). Anhand von Bindungsstudien konnte gezeigt werden, dass diese Methode die Selektivität und Bindekapazität signifikant erhöht. Diese innovative Technik wurde beispielsweise zur selektiven Abtrennung der Metalloproteasen MMP9 und MMP12 in Zellkulturüberständen erfolgreich angewandt [7].

Erstmalige Visualisierung der Bindung von Viren an MIP-Partikel

Dieses Konzept wurde am IABC weiterentwickelt, um nunmehr ganze Viren mittels molekular oberflächengeprägter Hybridmaterialien selektiv zu binden. In Zeiten von SARS-CoV-2 hat die Analyse von Viren sowie deren selektiver Nachweis neben dem zunehmenden Auftreten von Virusvarianten und Resistenzen unverhofft an Bedeutung gewonnen [8]. Bereits vor dieser Pandemie wurden am IABC erfolgreich Prägestrategien entwickelt, um ein für 5–10 % der Atemwegsinfektionen verantwortliches Virus – das humane Adenovirus Typ 5 – selektiv mittels biomimetischer Materialien zu binden [9]. In einer weiteren Innovation konnte gezeigt werden, dass durch die Zugabe von bovinem Serumalbumin unspezifische Wechselwirkungen größtenteils unterdrückt werden konnten [10]. Nicht zuletzt konnte im Rahmen dieser Studien erstmals die tatsächliche Bindung von Viren an MIP-Partikel mittels superauflösender STED-Fluoreszenzmikroskopie (engl. stimulated emission depletion, STED) visualisiert werden [11].

Entwicklung und Ausblick

Um das Prägen von Viren unter konventionellen Laborbedingungen ohne Nutzung der pathogenen Templates zu ermöglichen, wurde in weiterer Folge ein sogenannter Epitop-Ansatz entwickelt. Nur durch Prägung des Proteins Hexon, der wesentlichen viralen Kapsidproteinkomponente des humanen Adenovirus Typ 5, konnte dennoch im Anschluss das gesamte Virus selektiv auch in kompetitiven Bindungsstudien erfasst werden [12]. Laufende Forschungsarbeiten am IABC und bei Hahn-Schickard adaptieren diese Technologien derzeit auf weitere relevante Viren inklusive SARS-CoV-2 und Zika.

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Kategorie: Bioanalytik | Molekular geprägte Polymere

Literatur:
[1] Chen, W., Tian, X., He, W., Li, J., Feng, Y., Pan, G. (2020), Emerging functional materials based on chemically designed molecular recognition, BMC Mater., vol. 2, no. 1, 1–22, DOI: 10.1186/s42833-019-0007-1
[2] Zink, S., Moura, F. A., Autreto, P. A. D. S., Galvão, D. S., Mizaikoff, B. (2018) Efficient prediction of suitable functional monomers for molecular imprinting: Via local density of states calculations, Phys. Chem. Chem. Phys., vol. 20, no. 19, 13153–13158, DOI: 10.1039/C7CP08283E
[3] Zink, S., Moura, F. A., Autreto, P. A. D. S., Galvão, D. S., Mizaikoff, B. (2018) Virtually imprinted polymers (VIPs): Understanding molecularly templated materials: Via molecular dynamics simulations, Phys. Chem. Chem. Phys., vol. 20, no. 19, 13145–13152, DOI: 10.1039/c7cp08284c
[4] Dinc, M., Esen, C., Mizaikoff, B. (2019) Recent advances on core-shell magnetic molecularly imprinted polymers for biomacromolecules, TrAC - Trends Anal. Chem., vol. 114, 202–217, DOI: 10.1016/j.trac.2019.03.008
[5] Dinc, M. et al. (2018) Selective Binding of Inhibitor-Assisted Surface-Imprinted Core / Shell Microbeads in Protein Mixtures, ChemistrySelect, vol. 3, 4277–4282, DOI: 10.1002/slct.201800129
[6] Dinc, M., Basan, H., Diemant, T., Behm, R. J., Lindén, M., Mizaikoff, B. (2016) Inhibitor-Assisted Synthesis of Silica-Core Microbeads with Pepsin-Imprinted Nanoshells, J. Mater. Chem. B, 4462–4469, DOI: 10.1039/C6TB00147E
[7] Schauer, N. et al. (2018) Selective binding of matrix metalloproteases MMP-9 and MMP-12 to inhibitor-assisted thermolysin-imprinted beads, RSC Adv., vol. 8, no. 57, 32387–32394, DOI: 10.1039/C8RA04444A
[8] Gast, M., Sobek, H., Mizaikoff, B. (2019) Advances in imprinting strategies for selective virus recognition a review, TrAC - Trends Anal. Chem., vol. 114, 218–232, DOI: 10.1016/j.trac.2019.03.010
[10] Gast, M., Kühner, S., Sobek, H., Walther, P., Mizaikoff, B. (2018) Enhanced Selectivity by Passivation: Molecular Imprints for Viruses with Exceptional Binding Properties, Anal. Chem., vol. 90, no. 9, 5576–5585, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b05148
[11] Gast, M., Wondany, F., Raabe, B., Michaelis, J., Sobek, H., Mizaikoff, B. (2020) Use of Super-Resolution Optical Microscopy to Reveal Direct Virus Binding at Hybrid Core-Shell Matrixes, Anal. Chem., vol. 92, no. 4, 3050–3057, DOI: 10.1021/acs.analchem.9b04328
[12] Gast, M., Sobek, H., Mizaikoff, B. (2019) Selective virus capture via hexon imprinting, Mater. Sci. Eng. C, vol. 99, no. November 2018, 1099–1104, DOI: 10.1016/j.msec.2019.02.037

Publikationsdatum: 24.07.2020

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    Prof. Dr. Boris Mizaikoff

    Boris Mizaikoff, Jahrgang 1965, promovierte 1996 in Analytischer Chemie an der Technischen Universität Wien und hat sich im Jahr 2000 ebendort für das Fach Analytische Chemie habilitiert. Im Anschluss war er 2000–2007 am Georgia Institute of Technology (Atlanta, USA) an der School of Chemis ... mehr

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