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Der Gesetzgebung zufolge dürfen Lebensmittel, die mit einem Glutenfrei-Symbol versehen sind, nicht mehr als 20 mg Gluten pro Kilogramm enthalten, was für Zöliakie-Betroffene aus gesundheitlichen Gründen lebenswichtig ist. Gluten lässt sich zwar mit immunologischen, genomischen, chromatographischen und/oder massenspektrometrischen Methoden nachweisen, die Komplexität von Gluten aber stellt uns vor analytische Herausforderungen.
Gluten ist das Hauptspeicherprotein des stärkehaltigen Endosperms von Weizen-, Roggen- und Gerstenkörnern. Die komplexe Mischung aus mehr als hundert einzelnen Glutenproteinen ist eine Kombination aus einer polymeren Glutelinfraktion und der meist monomeren alkohollöslichen Fraktion, die Prolamin genannt wird. Die einzigartigen rheologischen Eigenschaften des Glutens aus Weizen, auch Weizenkleber genannt, machen Teig elastisch und dehnbar. Diese Eigenschaften sind für Produkte wie Brot, Nudeln und Gebäck unverzichtbar. Gluten hat jedoch wegen seiner Eigenschaft, Überempfindlichkeitsreaktionen bei genetisch prädisponierten Menschen auszulösen, viel Aufmerksamkeit erlangt. Zu den entsprechenden Erkrankungen zählen neben der Zöliakie die Weizenallergie, das Diarrhö-prädominante Reizdarmsyndrom und die Nicht-Zöliakie-Glutensensitivität [1].
In den meisten westlichen Ländern liegt die Prävalenz der Zöliakie bei etwa 1 %, was sie zu einer der häufigsten Nahrungsmittelunverträglichkeiten macht. Bei den betroffenen Patienten führt die Einnahme bestimmter Glutenpeptide (Eiweißbausteine) zu einer Überempfindlichkeitsreaktion, die eine chronische Entzündung und die Zerstörung der Dünndarmschleimhaut verursacht [2]. Dies hat schwerwiegende gesundheitliche Folgen wie Anämie, Mineralien- und Vitaminmangel oder verminderte Knochenmineralisierung aufgrund herabgesetzter Nährstoffresorption. Daher ist eine streng und lebenslang eingehaltene glutenfreie Ernährung die einzige Möglichkeit, den gastrointestinalen Symptomen beizukommen. Glutenhaltige Getreidearten, einschließlich Weizen, Gerste, Roggen und in einigen Fällen auch Hafer, müssen daher in der Ernährung vermieden werden. Dies gilt auch für alle potenziell kontaminierten Lebensmittel, wie z.B. Fertiggerichte. Eine Glutenaufnahme für Patienten mit Zöliakie von weniger als 20 mg pro Tag gilt als unbedenklich und verhindert Darmschädigungen [3]. Gemäß der Verordnung (EU) Nr. 1169/2011 und des Codex Alimentarius Standard 118-1979 (2015) dürfen Lebensmittel, die mit einem Glutenfrei-Symbol gekennzeichnet sind, den Glutengrenzwert von 20 mg/kg im Endprodukt nicht überschreiten [4]. Um die Lebensmittelsicherheit für Zöliakie-Betroffene zu gewährleisten, ist daher eine genaue Quantifizierung von Glutenspuren notwendig.
Die Anforderungen an die analytische Quantifizierung von Gluten sind im Codex Alimentarius-Standard 118-1979 (2015) geregelt. Für die korrekte Quantifizierung bedarf es einer immunologischen Methode oder einer anderen, hinsichtlich Sensitivität und Spezifität gleichwertigen Methode. Die verwendeten Antikörper müssen mit denjenigen Fraktionen der Glutenproteine reagieren, die für Menschen mit glutenabhängigen Krankheiten toxisch sind. Darüber hinaus dürfen sie keine Kreuzreaktivität mit anderen Inhaltsstoffen zeigen, und zur Methodenvalidierung sollte zertifiziertes Referenzmaterial verwendet werden, das eine Nachweisgrenze von 10 mg Gluten/kg oder niedriger ermöglicht [4].
Abb. 1 Das Grundprinzip der Enzymimmunoassays (ELISAs): A) Sandwich-ELISA. B) kompetitiver ELISA. Zur Erläuterung der nachfolgenden Schritte siehe Artikeltext.
Die gängigste Methode über Enzymimmunoassays (ELISAs) ist einfach anzuwenden und erfüllt die Anforderung des Codex für eine schnelle Glutenquantifizierung. Sie basiert auf einer Antikörper-Antigen-Reaktion, bei der das Antigen an einen Antikörper bindet. Dies führt zu einem messbaren Signal, das entweder direkt (Sandwich-ELISA) oder indirekt (kompetitiver ELISA) proportional zur Glutenkonzentration in der Probe ist. Bei Sandwich-ELISAs wird die Platte mit einer bekannten Menge des Fängerantikörpers beschichtet. Die Zugabe des Antigens aus der Probe führt dann zur Antigen/Antikörper-Bindung (Schritt a). Nach dem anschließenden Waschschritt wird der enzymmarkierte Nachweisantikörper hinzugefügt, der an eine zweite Stelle des Antigens bindet (Schritt b). Nach Entfernung überschüssiger Antikörper führt die Zugabe des Enzymsubstrats zu einer Farbreaktion (Schritt c, Abb. 1A). Bei kompetitiven ELISAs dagegen wird eine bekannte Menge des Antigens auf der Oberfläche der Platte immobilisiert. Die Probe, die das Antigen enthält, wird zeitgleich mit einer begrenzten, konstanten Menge enzymmarkierter Antikörper zugegeben, so dass immobilisierte und freie Antigene um die Antikörperbindungsstellen konkurrieren (Schritt a). Nach dem Waschschritt und der Zugabe des Enzymsubstrats bildet sich ein gefärbtes Produkt (Schritt b, Abb. 1B). Der Sandwich-ELISA nach Méndez et al. unter Verwendung des Antikörpers R5 wird besonders für intakte Glutenproteine empfohlen [5]. Der kompetitive R5 ELISA eignet sich für teilhydrolysierte Glutenproteine, die z.B. in Sauerteigprodukten, Stärkesirup, Malzextrakt und Bier vorkommen [6].
Aufgrund der komplexen Struktur und der besonderen Eigenschaften von Gluten ist die korrekte Quantifizierung in Lebensmittelmatrices mit immunologischen Methoden jedoch in mehrfacher Hinsicht problematisch. Verschiedene ELISA-Testsysteme erzielen nicht immer das gleiche Ergebnis, was auf Unterschiede der zur Kalibrierung verwendete Materialien und der Antikörperspezifitäten zurückzuführen ist. Ferner zielen die meisten Analyseverfahren nur auf die alkohollösliche Prolaminfraktion ab, von der man annimmt, dass sie rund 50 % des gesamten Glutengehalts ausmacht. Der Prolamin- und Glutelingehalt in Getreide variiert jedoch je nach Art, Sorte und den Umweltbedingungen während des Pflanzenwachstums [7]. Darüber hinaus erschwert das Fehlen standardisierter Referenzmaterialien und harmonisierter Analysemethoden den Vergleich quantitativer Ergebnisse.
Abb. 2 Ein typischer Workflow für Proteomik-Experimente, bei denen ungezielte und gezielte Flüssigkeitschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (LC-MS/MS) kombiniert werden
Eine vielversprechende und leistungsstarke Alternative zum ELISA ist der Nachweis von Gluten mittels Flüssigkeitschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (LC-MS/MS). Die Methode basiert auf dem vorherigen enzymatischen Aufschluss glutenhaltiger Proben. Dabei entstehen spezifische Peptide, die mit verschiedenen relativen Methoden (markierungsfreie Quantifizierung, intensitätsbasierte Absolutquantifizierung) oder absoluten Methoden (Stabilisotopenverdünnungsanalyse) quantifiziert werden können. Um geeignete Markerpeptide zu identifizieren, müssen zunächst ungezielte LC-MS/MS-Experimente durchgeführt werden, um ein Proteomprofil der aufgeschlossenen Proben zu erstellen. Diese Markerpeptide werden dann mit Hilfe von Datenbanken und Bioinformatik-Tools verifiziert und anschließend durch Zugabe von markierten internen Standards quantifiziert (Abb. 2) [7,8].
Im Vergleich zum ELISA erfordert die Quantifizierung mittels LC-MS/MS jedoch teure Geräte und großes Fachwissen. Außerdem ist die Umrechnung des Peptidgehalts in den ursprünglichen Glutengehalt äußerst schwierig, da Gluten während der Lebensmittelverarbeitung teilweise modifiziert werden kann, was zu Unterschieden in der Glutenzusammensetzung führt. Dennoch bieten LC-MS/MS-Methoden aufgrund ihrer Selektivität, Empfindlichkeit, Flexibilität und Anwendbarkeit ein großes Potenzial für die Quantifizierung von Gluten in Lebensmitteln. Daher empfehlen sich MS-Techniken als Ergänzung zum ELISA. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit, Multimethoden für den gleichzeitigen Nachweis von Gluten und anderen Allergenen zu entwickeln.
Genombasierte Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) können für ein sensitives Screening von Weizen, Roggen, Gerste oder Hafer in Lebensmitteln verwendet werden. Sie basieren auf der Amplifikation und dem Nachweis spezifischer DNA- oder RNA-Fragmente. Im Vergleich zum ELISA ist die quantitative Echtzeit-PCR (rt-qPCR) sensitiver und spezifischer, insbesondere für Rohstoffe. Selbst sehr niedrige Nukleotidkonzentrationen von 20 pg DNA/mg können bestimmt werden [9]. Allerdings eignen sich die Methoden aufgrund des DNA-Abbaus nicht für die Quantifizierung von stark hydrolysierten und verarbeiteten Lebensmittelproben. Daher sind keine Rückschlüsse auf den Proteingehalt und die für die Krankheit verantwortlichen Glutenproteine möglich. Nichtsdestotrotz werden genombasierte Methoden ergänzend zu anderen Analysemethoden eingesetzt, um das Vorhandensein bestimmter Getreidearten nachzuweisen[7].
Bei Menschen mit Zöliakie kann der Glutenkonsum schwere Gesundheitsprobleme verursachen, da er Überempfindlichkeitsreaktionen auslöst. Es hilft nur eine lebenslange glutenfreie Diät. Aus diesem Grund ist die genaue Quantifizierung von Glutenspuren in den als glutenfrei gekennzeichneten Lebensmitteln notwendig. EU-Bestimmungen legen für solche Lebensmittel einen Grenzwert von 20 mg/kg Gluten im Endprodukt fest. Gluten kann in Lebensmitteln über Methoden wie ELISA und LC-MS/MS quantifiziert werden. Dennoch stellt die Quantifizierung aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse, des Fehlens von standardisierten Referenzmaterialien und unzureichender Vergleichbarkeit quantitativer Ergebnisse noch immer eine Herausforderung dar. Folglich besteht nach wie vor ein großer Forschungsbedarf zur Verbesserung des Nachweises und der Quantifizierung von Gluten, um die Lebensmittelsicherheit für Zöliakie-Betroffene zu gewährleisten.
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Kategorie: Lebensmittelsicherheit | Gluten
Literatur:
[1] Scherf, K.A., Catassi, C., Chirdo, F., Ciclitira, P.J. et al. (2020) Recent progress and recommendations on celiac disease from the Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity, Front Nutr., 7, 29, DOI: 10.3389/fnut.2020.00029
[2] Jericho, H., Guandalini, S. (2018) Celiac Disease, Curr Pediatr Rep., 6, 40–49, DOI: 10.1007/s40124-018-0154-y
[3] Catassi, C., Fabiani, E., Iacono, G., D'Agate, C. et al. (2007) A prospective, double-blind, placebo-controlled trial to establish a safe gluten threshold for patients with celiac disease, Am J Clin Nutr., 85, 160–166, DOI: 10.1093/ajcn/85.1.160
[4] Codex Alimentarius Commission, Codex Standard 118-1979. Codex Standard for Foods for Special Dietary Use for Persons Intolerant to Gluten.
[5] Méndez, E., Vela, C., Immer, U., Janssen, F.W. (2005) Report of a collaborative trial to investigate the performance of the R5 enzyme linked immunoassay to determine gliadin in gluten-free food, Eur J Gastroenterol Hepatol., 17, 1053–1063. DOI: 10.1097/00042737-200510000-00008
[6] Gessendorfer, B., Koehler, P., Wieser, H. (2009) Preparation and characterization of enzymatically hydrolyzed prolamins from wheat, rye, and barley as references for the immunochemical quantitation of partially hydrolyzed gluten, Anal Bioanal Chem., 395, 1721–1728, DOI: 10.1007/s00216-009-3080-6
[7] Scherf, K.A., Poms, R.E. (2016). Recent developments in analytical methods for tracing gluten, J Cereal Sci., 67, 112–122, DOI: 10.1016/j.jcs.2015.08.006
[8] Colgrave, M.L., Goswami, H., Byrne, K., Blundell, M., et al. (2015) Proteomic profiling of 16 cereal grains and the application of targeted proteomics to detect wheat contamination, J Proteome Res., 14, 2659–2668, DOI: 10.1021/acs.jproteome.5b00187
[9] Mujico, J.R., Lombardía, M., Mena, M.C., Méndez, E., Albar, J.P. (2011) A highly sensitive real-time PCR system for quantification of wheat contamination in gluten-free food for celiac patients, Food Chem., 128, 795–801, DOI: 10.1016/j.foodchem.2011.03.061
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