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Wie lassen sich unbekannte Wirksubstanzen analysieren?

Substanzen entdecken, die für die Lebensmittelsicherheit entlang globaler Produktionsketten von Bedeutung sind

Prof. Dr. Gertrud Morlock (Justus-Liebig-Universität Gießen, Lehrstuhl für Lebensmittelwissenschaften – Food Science sowie Direktorin des TransMIT-Zentrums für wirkungsbezogene Analytik)

Mehr denn je sind Verbraucher über die Qualität und Sicherheit von Lebensmitteln besorgt. So ist beispielsweise bei Pflanzenextrakten, die in Lebensmitteln und Nahrungsergänzungsmitteln verwendet werden, Betrug weit verbreitet. Es ist offensichtlich, dass die Spezifikationen, die Qualitätskontrolle und die Regulierung von Pflanzenextrakten verbessert werden müssen [1-3].

Produkte werden nicht nur durch die natürliche Schwankungsbreite oder durch die Verarbeitung beeinträchtigt, sondern auch durch Kontaminationen, Rückstände, Verfälschungen, Abbauprodukte usw. entlang der globalen Produktionskette. Nicht selten werden preiswertere oder illegale Substanzen beigemischt. Über die wenigen bekannten bioaktiven Verbindungen in einer Lebensmittelprobe hinaus ist kaum bekannt, welche der Tausende andere Stoffe physiologisch aktiv sind und somit die Gesundheit der Verbraucher beeinträchtigen könnten. Bei regelmäßigem Konsum sind auch Spuren von bioaktiven Substanzen relevant, es z.B. für hormonelle Disruptoren bekannt ist [4].

Warum wir wirkungsbezogene Non-Target-Analytik brauchen

Die routinemäßige Qualitätskontrolle untersucht Produkte auf ihre Hauptinhaltsstoffe oder bekannte andere Verbindungen. Dadurch bleiben jedoch die meisten Lebensmittelbestandteile außerhalb des analytischen Fokus, was Tausende von Verbindungen zeigen, die durch leistungsfähige (umfassende) chromatographische Verfahren getrennt werden können. Es bleibt für die meisten gemessenen Signale unklar, zu welcher Verbindung sie gehören. Welcher analytische Aufwand lohnt sich für die gewaltige Herausforderung, Tausende von Verbindungen zu identifizieren? Sind wir analytisch auf dem richtigen Weg? Eine Analysetechnik, die diese komplexen Aufgaben meistert, sollte matrixtolerant sein und eine Diskriminierung von Inhaltsstoffen vermeiden. Die Probe sollte dem Trennsystem in möglichst ursprünglichem Zustand zugeführt werden, d.h. die Probenvorbereitung sollte minimalistisch sein.

Abb. 1 Analyse von bioaktiven unbekannten Verbindungen mittels HPTLC-UV/VIS/FLD-EDA-HRMS: A) Informationen über Polarität, Löslichkeit, spektrale und chemische Eigenschaften sowie mikrobiologische und biochemische Aktivitäten werden simultan für viele Proben auf einer einzigen Platte gewonnen.

Wenn die gesamte Lebensmittelprobe im Fokus steht, ist eine nicht zielgerichtete Analyse (Non-Target-Analytik) grundsätzlich einer zielgerichteten (Target-Analytik) überlegen. Nichtsdestotrotz lässt sich nur erkennen, was in dem verwendeten Analysesystem stabil, extrahierbar, trennbar und nachweisbar ist. Daher sind eine minimalistische Probenbehandlung und verschiedene Detektionsverfahren ein Muss. Schließlich kann auch die Massenspektrometrie, wie sie üblicherweise angewendet wird, nicht alles leisten, denn unter Standardeinstellungen und mit Elektrospray-Ionisation ionisiert nicht jedes Molekül.

Bisher wurden zur Beurteilung der Produktqualität ausgewählte chemische Markerverbindungen verwendet, die jedoch nicht die gesamte Komplexität der Probe darstellen können. Bioprofiling oder wirkungsbezogene Fingerprints gewährleisten eine viel bessere Produktqualität und insbesondere -sicherheit über die gesamte globale Produktionskette.

Abb. 1 B) Klassifizierung von wirkungsbezogenen In-situ-Assays

Deutlich ist, dass Chromatographie in Kombination mit einer wirkungsbezogenen Analytik den reinen Mikrotiterplatten-Assays überlegen ist. Neben einem Summenparameter sind weitere Details zu den beobachteten Effekten für solche komplexen Systeme erforderlich, wie z.B. Lebensmittel. Der Bedarf an Informationen über einzelne Wirkstoffe ist unvermeidlich.

Wirkungsbezogene Profiling- und Imaging-Techniken

Unser Gehirn und unser Verstand werden auf eine hocheffiziente Weise trainiert, um Bilder auszuwerten, die wir jede Sekunde, jeden Tag sehen. Die Datenerfassung als Bild und deren Analyse durch künstliche Intelligenz liegt heute im Trend.

Abb. 1 C) Prinzip durch Assays die Tausende von Verbindungen auf die relevanten aktiven Substanzen einzugrenzen

Die Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) ist eine bildgebende Technik, bei der die Bestandteile von nebeneinander getrennten Proben leicht und schnell verglichen werden können. Wird dieses planare Bild samt allen gespeicherten Komponenten mit Bioassays, Rezeptorassays oder enzymatischen Assays gekoppelt (wirkungsbezogene Analytik), gewinnt man neuartige Informationen. Zusätzlich zu spektralen, chemischen, Polaritäts- und Löslichkeits-Daten werden wirkungsbezogene mikrobiologische bzw. biochemische Fingerprints gewonnen, die sich mit künstlicher Intelligenz auswerten lassen [3] (Abb. 1).

So wurden beispielsweise Hefezellen, die den menschlichen Östrogenrezeptor hRα und ein Reportergen für das Enzym β-D-Galactosidase enthalten, kultiviert und auf das Chromatogramm gebracht [4]. Mit einem fluorogenen Substrat (4-Methylumbelliferyl-β-D-Galaktosid) sind hormonaktive Stoffe wie Östrogene als blaue fluoreszierende Zonen in vielen Lebensmitteln nachweisbar (Abb. 2).

Abb. 2 Analyse unbekannter, östrogenähnlich-wirkender Hormone mittels HPTLC-planar yeast estrogen screen (pYES): Saccharomyces cerevisiae-Zellen mit dem humanen Östrogenrezeptor hRα und dem Reportergen für die β-D-Galactosidase wurden auf das Chromatogramm gebracht, das östrogenähnlich-wirkende Hormone über das fluorogene Substrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galaktosid (MUG) in Lebensmitteln und Abwässern als blaue fluoreszierende Zone nachgeweist, mit nachfolgender massenspektrometrischer Charakterisierung (A). Der Workflow für die HPTLC-UV/VIS/FLD-pYES-HRMS benötigt nur 15 Minuten pro Probe (B), berechnet für mehrere Proben in parallel auf einer Platte.

Laut John Tukey, einem amerikanischen Statistiker, ist es viel besser, eine ungefähre Antwort auf die richtige Frage zu geben („Worauf kommt es an?“) als eine genaue Antwort auf die falsche (z.B. wenn man nur berücksichtigt, was bekannt ist und detektiert bzw. analysiert werden kann). Weitere In-situ-Assays wurden bereits gezeigt, die Antibiotika, genotoxische Verbindungen oder verschiedene enzymhemmende Verbindungen nach wirkungsbezogenem Profiling von Pflanzenextrakten und funktionellen Lebensmitteln nachweisen [1-8]. Zur Charakterisierung der nachgewiesenen aktiven Stoffe wurden quantitative Oberflächenscans mittels direkter Analyse per Echtzeit-Massenspektrometrie (DART-MS) [7] eingesetzt sowie ein elutionskopfbasiertes Interface zum Transfer von Wirkzonen direkt von der Platte in das Massenspektrometer [6, 8]. Diese effiziente, wirkungsbezogene Profiling-Technik kann auch über die aktiven Wirkmechanismen traditioneller Medizin Erkenntnisse liefern und die Erforschung bzw. Qualitätskontrolle gesundheitsfördernder und funktioneller Lebensmittel unterstützen. Solch unkomplizierte, kombinierte bioanalytische Bildgebungstechniken können helfen, mit hoher Effizienz unbekannte aktive Stoffe zu entdecken (Abb. 3). Interessierte können zur Weiterbildung unser HPTLC-EDA-HRMS-Modul buchen.

Abb. 3 Einfache, kombinierte bioanalytische Bildgebungstechnik zum Nachweis von physiologisch aktiven unbekannten Unbekannten [1]. Leicht modifiziert, mit Genehmigung von © Elsevier Amsterdam 2019

Qualitätskontrollen durch interessierte Laien

Mehr und bessere Analytik zur Überprüfung der Qualität von Lebensmitteln, Nahrungsergänzungsmitteln, Nutraceuticals, Kosmetika, Arzneimitteln, Umweltproben usw. ist dringend erforderlich. Die sogenannte „Bürgerwissenschaft“ (Citizen Science) beteiligt Bürgerinnen und Bürger an der Gewinnung von wissenschaftlichen Erkenntnissen. Ein frei zugängliches Open-Source-Analytiktool könnte wesentlich zur Verbesserung der Produktqualität beitragen, wenn hochmotivierte Laien schnelle Produktuntersuchungen durchführen könnten. Obwohl Spektraltechniken viel leisten, gibt es bisher kein optimales Open-Source-Tool. Daher liegt der Fokus in der Chromatographie auf der Miniaturisierung, neuen Denkansätzen und innovativen Technologien (Abb. 4) [9].

Abb. 4 Metapher für UHPLC, HPTLC und OC im Zeitalter der ultraschnellen Trennungen: Die Metro ist in der Stadt höchstwahrscheinlich schneller und Sie benötigen kein Styling (keine Probenvorbereitung); anders denken und neueste Technologien nutzen wie bei OC.

Das Potenzial von Open-Source-Hardware und -Software, 3D-/Tintenstrahldruckern, hochwertiger Bildauswertung durch maschinelle Lernalgorithmen und künstlichen neuronalen Netzen wird genutzt [9-11] und mit miniaturisierten Trennungen kombiniert (Ultra-Dünnschicht-Chromatographie, ultrathin-layer chromatography, UTLC) [12]. Das Office Chromatography Laboratory (OC Lab), das alle Schritte der Planar-Chromatographie in einem einzigen, integrierten und miniaturisierten System vereint, wurde kürzlich vorgestellt [11]. Anstelle von Druckerfarbe auf Papier werden chemische Lösungen auf Schichten gedruckt. Probenaufbringung, Entwicklung und Derivatisierung wurden über einen einfachen Tintenstrahldruckkopf bewerkstelligt.

Im Prinzip sind Open-Source-Entwicklungen wie Radikalkettenreaktionen: Sie entfalten sich hochdynamisch und mit exponentieller Geschwindigkeit. In vielerlei Hinsicht ist dies ein interessantes Experiment, zu dem es sich lohnt, einen Beitrag zu leisten.

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Infobox

Wirkungsbezogene Analytik mittels HPTLC-Bioassay-HRMS,
Modul an der JLU Gießen, 26.02.–01.03.2020:
Das 5-tägige Praktikum befasst sich mit verschiedenen Assays. Der vollständige Arbeitsablauf HPTLC-UV/VIS/FLD-Assay-ESI-HRMS- bzw. DART-MS wird gezeigt. Einzelne Tage können per E-Mail gebucht werden, wie im Flyer auf unserer Homepage vermerkt.

Offene Ausschreibungen für Doktoranden finden Sie auch auf unserer Homepage.

(A.d.R.: Die Funktion „Weiterführender Link“ oben rechts führt direkt zur Homepage des Lehrstuhls für Lebensmittelwissenschaften – Food Science, Justus-Liebig-Universität Gießen.)

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Kategorie: Wirkungsbezogene Analytik | Lebensmittelsicherheit

Literatur:
[1] Morlock, G.E. (2019) Bioassays | Effects-Detection in Chromatography, in: Worsfold, P.J., Poole, C., Townshend, A., Miro, M. (Eds.) Reference Module in Encyclopedia of Analytical Science, Third Edition, Amsterdam, Elsevier Science, 261-270
[2] Krüger, S., Bergin, A., Morlock, G.E. (2018) Effect-directed analysis of ginger (Zingiber officinale) and its food products, and quantification of bioactive compounds via high-performance thin-layer chromatography and mass spectrometry, Food Chem., 243, 258-268, DOI: 10.1016/j.foodchem.2017.09.095
[3] Fichou, D., Morlock, G.E. (2018) Powerful artificial neural network for planar chromatographic image evaluation, shown for denoising and feature extraction, Anal. Chem., 90, 6984-6991, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b01298
[4] Morlock, G.E., Klingelhöfer, I. (2014) Liquid chromatography-bioassay-mass spectrometry for profiling of physiologically active food, Anal. Chem., 86, 8289–8295, DOI: 10.1021/ac501723j
[5] Jamshidi-Aidji, M., Morlock, G.E. (2016) From bioprofiling and characterization to bioquantification of natural antibiotics by direct bioautography linked to high-resolution mass spectrometry: Exemplarily shown for Salvia miltiorrhiza root, Anal. Chem., 88, 10979−10986, DOI: 10.1021/acs.analchem.6b02648
[6] Jamshidi-Aidji, M., Morlock, G.E. (2019) Fast equivalency estimation of unknown enzyme inhibitors in situ the effect-directed fingerprint, shown for Bacillus lipopeptide extracts, Anal. Chem., 90, 14260–14268, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b03407
[7] Häbe, T.T., Jamshidi-Aidji, M., Macho, J., Morlock, G.E. (2018) Direct bioautography hyphenated to direct analysis in real time mass spectrometry: Chromatographic separation, bioassay and mass spectra, all in the same bioautogram, J. Chromatogr. A, 1568, 188-196, DOI: 10.1016/j.chroma.2018.07.002
[8] Azadniya, E., Morlock, G.E. (2019) Automated piezoelectric spraying of biological and enzymatic assays for effect-directed analysis of planar chromatograms, J. Chromatogr. A, 1602, 458-466, DOI: 10.1016/j.chroma.2019.05.043
[9] Morlock, G.E. (2015) Miniaturized planar chromatography using office peripherals – Office chromatography, J. Chromatogr. A, 1382, 87-96, DOI: 10.1016/j.chroma.2014.09.050
[10] Fichou, D., Morlock, G.E. (2017) Open-source-based 3D printing of thin silica gel layers in planar chromatography, Anal. Chem., 89, 2116-2122, DOI: 10.1021/acs.analchem.6b04813
[11] Fichou, D., Morlock, G.E. (2018) Miniaturized all-in-one open-source system for planar chromatography, Anal. Chem., 90, 12647-12654, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b02866
[12] Kirchert, S., Schulz, M., Oberle, M., Morlock, G.E. (2019) Development of a new particulate 4-μm adsorbent layer for ultrathin-layer chromatography (miniaturized chromatogram), J. Chromatogr. A, 1587, 247-255, DOI: 10.1016/j.chroma.2018.11.035

Publikationsdatum: 22.10.2019

Fakten, Hintergründe, Dossiers

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    Prof. Dr. Gertrud Morlock

    Gertrud Morlock, Jahrgang 1966, studierte Ernährungswissenschaften und promovierte in Chemie unter Betreuung von Prof. Dr. Helmut Jork und Prof. Dr. Heinz Engelhardt an der Universität des Saarlandes. Sie arbeitete mehrere Jahre für weltweit führende Industrieunternehmen und kehrte 2004 in ... mehr

    Prof. Dr. Andreas Vilcinskas

    Andreas Vilcinskas, Jg. 1964, studierte Biologie an der TU Kaiserslautern und an der Freien Universität Berlin. Er promovierte 1994 am Institut für Zoologie der FU Berlin und habilitierte sich dort 1998 im Fachgebiet Zoologie. Von 1999 bis 2004 vertrat er als Gastprofessor den Lehrstuhl für ... mehr

    Dr. Rolf-Alexander Düring

    Rolf-Alexander Düring, geb. 1964, studierte Agrarwissenschaften, Fachrichtung Umweltsicherung und Entwicklung ländlicher Räume an den Universitäten in Bonn und Gießen und promovierte 1996 am Institut für Phyto­pathologie und Angewandte Zoologie, Gießen. Nach der Habilitation am Institut für ... mehr

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