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Elementanalytische Verfahren werden heute zu mehr eingesetzt als bloß zur Bestimmung von Metallgesamtgehalten in diversen Probenmatrizes. Sie stellen heute ein wichtiges Werkzeug zur Beantwortung lebenswissenschaftlicher Fragen aus Umwelt, Medizin und Biologie dar. In der vorliegenden Arbeit kommt die single-cell-ICP-Flugzeitmassenspektrometrie (single-cell-ICP-TOF-MS) zur Multielementanalytik in einzelnen Kieselalgen (Diatomeen) zum Einsatz und wird zukünftig ein wichtiges Werkzeug z.B. bei der Beantwortung ökotoxikologischer Fragestellung sein.
Diatomeen sind ein essenzieller Bestandteil des eukaryotischen Phytoplanktons und einer der Schlüsselorganismen in der marinen Umwelt (Abb. 1). Die entscheidende Rolle, die sie dabei spielen, fußt auf zwei Hauptfaktoren: (i) zum einen stellen sie die Basis des pelagischen Nahrungsnetzes dar und (ii) sind aufgrund ihrer Eigenschaft, Photosynthese zu betreiben, ein integraler Bestandteil der Kohlenstoffdioxidfixierung [1, 2]. Auf Grund ihrer äußerst hohen Anpassungsfähigkeit gibt es weit über 100.000 Arten, die sich in Größe, Form und Habitat stark voneinander unterscheiden können. Die Vielfältigkeit dieser Organismen macht sie interessant, um sie als Indikator für unterschiedliche Formen von Umwelteinflüssen einzusetzen – als ökotoxikologische Testorganismen [3]. Algen haben daher ihren Weg in verschiedene nationale und internationale Vorschriften und Testverfahren gefunden, die auf die Beurteilung von Substanzen abzielen, wie beispielsweise in unterschiedliche DIN-Normen, in die REACH-Verordnung oder in die Europäische Wasserrahmenrichtlinie. Diese normierten und standardisierten Tests zielen, aufgrund der Einfachheit und der Aussagekraft, meist auf das Photosystem der Algen ab, das mittels Fluoreszenz vermessen wird. Dies lässt eine Aussage über die Anzahländerung der Algen in einer Population im Vergleich zu einer Kontrollprobe zu; hierüber können Informationen zur Toxizität von Testsubstanzen abgeleitet werden. Jedoch eignet sich diese Methode nur für Reinsubstanzen und nicht für die Untersuchung von Mischungstoxizitäten.
Weiterhin wird über Fluoreszenzmessungen keine Information über tatsächlich akkumulierte Konzentrationen der Testsubstanzen erhalten. Werden Metalle inkubiert, lässt sich der Gesamtgehalt in einer größeren Anzahl Algen als Mittelwert via ICP-OES oder ICP-MS nach Mikrowellendruckaufschluss ermitteln. Jedoch geht die Information der Variation des Metallgehaltes innerhalb einer Zellpopulation verloren [4]. Daten auf Basis einzelner Algen und somit Abbildungen der Metallvariation in einer Population lassen sich nur mittels single-cell-ICP-MS erzielen [5]. Hierbei wird die Algensuspension direkt ins Plasma eingetragen. Durch ausreichende Verdünnung wird sichergestellt, dass nur eine Alge pro Zeitintervall gemessen wird [6]. Da dies bei sehr geringen Integrationszeiten erfolgt, können klassische Detektoren, wie z.B. Quadrupole nur ein Isotop erfassen. Im Hinblick auf Anwendungen, wie die Bewertung von Mischungstoxizitäten werden jedoch Multielementinformationen in jeder einzelnen Alge benötigt – diese lassen sich nur mit Methoden erzielen, die eine quasi simultane Multielementdetektion pro Zeitintervall ermöglichen; dies leistet die ICP-TOF-MS. Neben simultaner Multielementinformation pro Alge lässt sich zusätzlich über die Anzahl der detektierten Ereignisse auf die Anzahl Algen in der jeweiligen Probe rückschließen – im Rahmen unserer Forschung möchten wir zukünftig die Informationsfülle aus Elementkonzentration pro Alge und Anzahl Algen nutzen, um eine detailliertere und genauere ökotoxikologische Bewertung auf Basis von realen Messdaten abzuleiten. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse legen die Basis für unsere weitere Forschungsarbeit.
Abb. 2 A) Single-cell-ICP-TOF-MS-Rohdaten (Cyclotella meneghiniana) vier charakteristische „Fingerabdruck-Elemente“ wurden als Basis für die Datenextraktion gewählt; B) vergrößerter Bereich: Auf Basis des Elementfingerabdrucks können „nicht Algenevents“ von Algen unterschieden werden.
Herkömmliche ICP-MS-Systeme „scannen“ den Massenbereich, so dass immer nur ein Element/Isotop pro Zeitsegment (dwell) durch den Detektor erfasst werden kann. Seit ein paar Jahren erlebt die ICP-TOF-MS eine wahre Renaissance – hierüber lässt sich (quasi) simultan das komplette Elementmassenspektrum in kurzen transienten Signalen mit hoher Aufnahmerate und Auflösung erfassen. Somit kann in einer einzelnen Zelle nahezu das gesamte Periodensystem abgebildet werden.
Für Kieselalgen sind besonders Silizium, Magnesium, Phosphor und Eisen relevante Elemente. Silizium ist dabei der Hauptbestandteil ihrer Hülle; Magnesium spielt eine zentrale Rolle in der Photosynthese und Eisen und Phosphor erfüllen wichtige Aufgaben in der Zelldynamik, somit sind diese vier Elemente „Fingerabdruck-Elemente“ der Kieselalgen. In Abbildung 2 sind die Elementspuren der genannten Elemente für eine typische single-cell-ICP-TOF-MS-Messung der Kieselalge Cyclotella meneghiniana (CM, Abb. 1) dargestellt. Liegen die vier dargestellten Elementspuren perfekt übereinander (Abb. 2 B), ist dies ein eindeutiger Beleg für das Auftreten eines Algenevents im Plasma – somit können Algen über ihren „Elementfingerabdruck“ identifiziert und vom Untergrund abgetrennt werden. Hierüber können, wie in Abbildung 2 B dargestellt, „zufällige Ereignisse“ von tatsächlichen Algenevents unterschieden werden. Im Fall der untersuchten Algenproben kommen auf ein Algenevent bis zu fünf zufällige Events – simultane Multielementanalytik liefert somit valide single-cell-Daten [7].
Aus den so erhaltenen Daten lässt sich eine Aussage darüber treffen, ob ein Algenevent im Plasma aufgetreten ist, und somit mit vorheriger Kalibrierung der Transporteffizienz des verwendeten Eintragssystems die Anzahl der Algen in der verwendeten Probe ermitteln. Um jedoch Informationen über (i) die vorliegende Algenspezies, oder (ii) ihre „lifecycle phase“ gewinnen zu können sind leistungsfähigere Modelle nötig. Hier liefert die multivariate Datenauswertung vielfältige Einsatzmöglichkeiten, wie z.B. Hauptkomponentenanalyse, Regressionsanalyse, Diskriminanzanalyse.
Abb. 3 Hauptkomponentenanalyse von single-cell-ICP-TOF-MS-Analysedaten der Alge Cyclotella meneghiniana nach Exposition mit unterschiedlichen Zinkkonzentrationen (0; 0,1; 0,5; 1; 5 mg L-1)
Ein Beispiel für die Leistungsfähigkeit der Kombination aus simultaner Multielementanalytik mittels ICP-TOF-MS und multivariater Datenauswertung ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Kieselalgenspezies Cyclotella meneghiniana wurde hierbei einem Umweltstress, in Form der Zugabe unterschiedlicher Zinkkonzentrationen (0,1 mg∙L-1, 0,5 mg∙L-1, 1 mg∙L-1, 5 mg∙L-1) ausgesetzt. Die Algenevents wurden wie oben beschrieben aus dem Datensatz extrahiert und mittels Hauptkomponentenanalyse untersucht. Das Ergebnis der Analyse zeigt deutlich eine Aufspaltung der verschiedenen Expositionskonzentrationen in ihre jeweilige Gruppe. Dieser Ansatz bietet vielfältige Einsatzmöglichkeiten z.B. im Bereich der Ökotoxikologie. Neben der Erfassung der Anzahl der Algen in einer Population werden simultan die aufgenommene Konzentration und kleinste Veränderungen im Elementfingerabdruck erfasst – die Informationsdichte gegenüber einer Fluoreszenzmessung ist um ein Vielfaches höher – zukünftig können somit auch z.B. Mischungstoxizitäten von Stoffen untersucht werden.
Abb. 4 Diskriminanzanalyse von single-cell-ICP-TOF-MS-Daten nach Analyse von drei Kieselalgenspezies – Thalassiosira weissflogii (TW), Phaeodactylum tricornutum (PT), Cyclotella meneghiniana (CM)
Multivariate Datenanalyse erlaubt jedoch nicht nur die Unterscheidung verschiedener Expositionslevel, sondern auch die Zuordnung von Algen zu ihrer jeweiligen Spezies. In Abbildung 4 konnten drei verschiedene Kieselalgenspezies (Thalassiosira weissflogii (TW), Phaeodactylum tricornutum (PT) und Cyclotella meneghiniana (CM)) anhand ihres charakteristischen „Elementfingerabdruckes“ mittels Diskriminanzanalyse unterschieden werden. Ein mögliches Anwendungsfeld ist hierbei z.B. die Untersuchung der Artenvielfalt in Oberflächengewässern und somit z.B. Auswirkungen von Veränderungen der Gewässerqualität.
Die Kombination aus allen Informationen erlaubt somit zukünftig eine Unterscheidung der Spezies sowie Bewertung ihres Belastungszustandes in Umweltmatrizes und schlägt so eine Brücke zwischen innovativen elementanalytischen Verfahren und der ökotoxikologischen Bewertung von Substanzen.
Single-cell-ICP-TOF-MS ermöglicht die (quasi) simultane Multielementanalyse einzelner Zellen in kurzer Zeit. Über charakteristische Elementfingerabdrücke lassen sich mit hoher Zuverlässigkeit Algen aus einem großen Datensatz extrahieren. Die erhaltenen Rohdaten liefern in Kombination mit multivariater Statistik wertvolle Hinweise auf die Belastungssituation der Algen.
Anhand der Daten können zukünftig, nach entsprechender Validierung, z.B. ökotoxikologische Grenzwerte für Schadstoffe abgeleitet werden. Weiterhin können die Techniken auch bei medizinischen und toxikologischen Fragestellungen wertvolle Beiträge leisten – hierüber lassen sich etwa humane Zelllinien mit kritischen Elementen inkubieren und Aussagen zur Toxikologie treffen.
Somit verschmelzen elementanalytische Werkzeuge immer stärker mit lebenswissenschaftlichen Fragestellungen aus Umwelt, Medizin und Biologie – ein Trend, der sich in Zukunft verstärkt fortsetzen wird.
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Kategorie: Umweltanalytik | Einzelzellanalyse
Literatur:
[1] Ianora, A., Miralto, A. (2010) Toxigenic effects of diatoms on grazers, phytoplankton and other microbes: a review, Ecotoxicology, 19, 493-511, DOI: 10.1007/s10646-009-0434-y
[2] Falkowski, P. G., Barber, R. T., Smetacek, V. V. (1998) Biogeochemical Controls and Feedbacks on Ocean Primary Production, Science, 281, 200-207, DOI: 10.1126/science.281.5374.200
[3] Falciatore, A., Bowler, C. (2002) Revealing the molecular secrets of marine diatoms, Annu. Rev. Plant Biol., 53, 109-130, DOI: 10.1146/annurev.arplant.53.091701.153921
[4] Miyashita, S.-i., Groombridge, A. S., Fujii, S.-i., Takatsu, A. et al. (2014) Anal. Sci., 30, 219-224, DOI: 10.2116/analsci.30.219
[5] Ho, K.-S., Chan, W.-T. (2010) Time-resolved ICP-MS measurement for single-cell analysis and on-line cytometry, J. Anal. At. Spectrom., 25, 1114-1122, DOI: 10.1039/C002272A
[6] Von der Au, M., Schwinn, M., Kuhlmeier, K., Büchel, C., Meermann, B. (2019) Development of an automated on-line purification HPLC single cell-ICP-MS approach for fast diatom analysis, Anal. Chim. Acta, 1077, 87-94, DOI: 10.1016/j.aca.2019.05.045
[7] Von der Au, M., Borovinskaya, O., Flamigni, L., Kuhlmeier, K., Büchel, C., Meermann, B., submitted for publication
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