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Bewertung der Lungentoxizität von Luftschadstoffen

Automatisierte Exposition menschlicher Lungenzellen an der Gas-Flüssigkeitsgrenzschicht

Dipl. Ing. Sonja Mülhopt (Karlsruher Institut für Technologie (KIT), Institut für Technische Chemie), Dr. Hanns-Rudolf Paur (Karlsruher Institut für Technologie (KIT), Institut für Technische Chemie)

Die aktuellen Diskussionen zu Fahrverboten in europäischen Städten zeigen einerseits den hohen Stellenwert, den die Bevölkerung der Luftqualität zumisst, und andererseits den Mangel an Methoden, die von Luftschadstoffen ausgehende Beeinträchtigung der menschlichen Gesundheit direkt zu bewerten. Die realitätsnahe Exposition menschlicher Lungenzellen an der Gas-Flüssigkeitsgrenzschicht gegenüber Aerosolen verspricht wesentliche Fortschritte und wird zunehmend von führenden Instituten weltweit eingesetzt.

Die heutigen Grenzwerte von Luftschadstoffen beruhen teilweise auf epidemiologischen Studien, die Mortalität und Morbidität mit Messwerten aus öffentlichen Messnetzen korrelieren. Diese Assoziation zeigt die Wirkung von Luftschadstoffen auf die menschliche Gesundheit auf, kann aber deren unmittelbare Wirkung ohne zusätzliche toxikologische Messungen nicht beweisen.

Vorteilhafter ist es die biologischen Wirkungen der Luftschadstoffe als Dosis-Wirkungsbeziehungen direkt zu messen. Daher werden zusätzlich Tierversuche und In-vitro-Tests mit Zellkulturen eingesetzt, um eine direkte Bewertung der Wirkung von Luftschadstoffen auf biologische Systeme zu erreichen. Richtlinien der OECD für Tierversuche zur Messung der akuten Lungentoxizität von Chemikalien liegen vor, werden aber aus ethischen und finanziellen Gründen für Luftschadstoffe nur in Einzelfällen eingesetzt.

Verfahren zur Bewertung der Toxizität von Luftschadstoffen mit menschlichen Zellen sind bisher nicht standardisiert. In Laborexperimenten werden meist gesammelte Partikeln als Suspension auf menschliche Lungenzellen aufgebracht. Abgesehen von den nicht physiologischen Bedingungen dieser Zellexperimente, sind die so erzielten Ergebnisse nicht geeignet, die Wirkung realer, also komplex zusammengesetzter Aerosole aus der Verbrennung zu bewerten. Die Abschätzung der applizierten Dosis ist zudem problematisch.

Ein automatisiertes System zur reproduzierbaren Exposition von menschlichen Zellen

Im Folgenden werden unsere Entwicklungen zur simultanen Messung der biologischen Effekte und der Partikeldosis von Aerosolen mit einem Expositionssystem für menschliche Lungenzellen dargestellt. Dieses System ermöglicht sowohl die reproduzierbare Probenahme und Konditionierung von Aerosolen als auch die Exposition der Zellkulturen unter Bedingungen, die der menschlichen Lunge nachempfunden sind. Bei Anwendungen dieses Verfahrens in großen Messkampagnen konnte seine Eignung für komplexe Verbrennungsaerosole gezeigt werden. Das Expositionssystem wird mittlerweile von der Fa. Vitrocell Systems GmbH (Waldkirch) hergestellt und weltweit vertrieben (Abb. 1). Die Grundlagen des Verfahrens wurden von Paur et. al (2011) zusammengefasst [1].

Abb. 1 (A) Expositionsszenario in einer Expositionskammer: die gasgetragenen Partikeln werden durch das Aerosolinlet direkt an die Oberfläche der menschlichen Lungenzellen gebracht. (B) Das automatisierte Expositionssystem zur Beaufschlagung von Zellen mit Aerosolen (Foto: Fa. Vitrocell Systems GmbH)

Im Expositionssystem werden die Zellen in parallel angeordneten Expositionsmodulen auf Membranen kultiviert und basal mit Nährmedium versorgt. Das mit einem größenselektiven Einlass klassierte Aerosol wird auf eine Temperatur von 37 °C und 85 % relative Feuchte konditioniert und direkt über die Zelloberfläche geleitet und dort deponiert. Durch Kontrollmessungen in parallel angeordneten Kammern können Replikate und simultane Kontrollmessungen mit Reinluft und filtriertem Aerosol durchgeführt werden sowie die deponierte Partikeldosis gemessen werden. Die exponierten Zellproben werden im Weiteren mit standardisierten Bioassays untersucht, um biologische Endpunkte zu quantifizieren, die Aufschluss über Mechanismus und Wirkung der Aerosole geben. Mit der Dosis-Wirkungsbeziehung ist eine Bewertung der Toxizität möglich, die z.B. durch Entzündung oder DNA-Schäden verursacht wird [2].

Die Exposition von Zellkulturen an der Gas-Flüssigkeitsgrenzschicht hat mehrere Vorteile: Durch die direkte Probenahme aus dem Abgasstrom entfällt das aufwendige und fehlerbehaftete Sammeln von Partikeln auf Filtern. Die Zellkulturen können gleichzeitig oder separat mit Gasen oder Partikeln beprobt werden. Zudem entfällt die Resuspension von Partikeln in biologischen Medien, die zu chemischen und physikalischen Veränderungen der Partikel führt und die Bestimmung der applizierten Dosis erschwert. Schließlich werden die Partikel, ähnlich wie in der menschlichen Lunge direkt auf die Zelloberfläche deponiert, ohne Verfälschung der biologischen Effekte durch ein Lösungsmittel. Durch Regelung der Temperatur, Feuchte und Volumenstrom wird eine hohe Reproduzierbarkeit der Depositionseffizienz und damit auch der nachfolgenden biologischen Messungen erreicht. Die Erfassung aller relevanten physikalischen Parameter ermöglicht den Nachweis einer fehlerfreien Versuchsdurchführung bzw. die schnelle Identifikation von Fehlerquellen. Durch die weitgehende Automatisierung des Expositionssystems werden die Einhaltung des voreingestellten Versuchsprotokolls und damit die Reproduzierbarkeit bei Reihenmessungen gewährleistet.

Unter Standardbedingungen werden nur etwa 1,5 % der Partikelkonzentration auf den Zellen abgelagert und somit eine Überdosierung vermieden. Die applizierte Dosis kann ab einer Oberflächenkonzentration von 20 ng/cm2 durch eine im System integrierte Quarzmikrowaage (QCM) bestimmt werden. Bei niedrigeren Konzentrationen kann bei bekannter Dichte des Aerosols die Bildauswertung beladener Oberflächen wie Transmissionselektronenmikroskopie-Grids eingesetzt werden, um die Dosis abzuschätzen. Um die Depositionseffizienz zu erhöhen, wurde ein elektrisches Feld in das Expositionsmodul integriert. Hierdurch kann die deponierte Dosis entsprechend dem Ladungszustand des Aerosols bis zum Faktor 10 erhöht werden.

Anwendungen des Expositionsverfahrens und Ausblick

Abb. 2 Stand der Technik: Untersuchte Aerosole (Spalte oben links) und Zellkulturen (Spalte oben rechts) sowie Bioassays aus Zellkulturen und Endpunkte zur Bestimmung der Wirkung

Insbesondere in den letzten Jahren setzen Forschungsinstitute und Firmen die Methode zunehmend ein. Messungen von Dosis-Wirkungsbeziehungen wurden an den in der Abbildung 2 dargestellten Aerosolen und Zellkulturen durchgeführt. Ein aktueller Überblick zum Stand der Technik wird von Lacroix et.al (2018) gegeben [3]. Bei der Untersuchung komplexer Verbrennungsaerosole können die biologischen Effekte gas- und partikelförmiger Schadstoffe gleichzeitig bestimmt werden.

Aktuelle Forschungsarbeiten zielen darauf ab, die Expositionszeiten bis auf 48 Stunden zu verlängern und die deponierte Dosis zu erhöhen, um das Verfahren auch bei niedrigeren Konzentrationen in der Außenluft einzusetzen. Im Weiteren ist die Validierung des Verfahrens durch Tierversuche erforderlich, um die Anzahl der Versuchstiere bei gesetzlich vorgeschriebenen Tests zu verringern.

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Kategorie: Toxikologie | Aerosole

Literatur:
[1] Paur, H.-R., Cassee, F.R., Teeguarden, J. et al. (2011) In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung – A dialog between aerosol science and biology, J Aerosol Sci 42, 668-692, DOI: 10.1016/j.jaerosci.2011.06.005
[2] Mülhopt, S., Dilger, M., Diabate, S. et al. (2016) Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a selfcontained and easy-to-use exposure system, J Aerosol Sci 96, 38-55, DOI: 10.1016/j.jaerosci.2016.02.005
[3] Lacroix, G. et al. (2018) Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations, Appl In Vitro Toxicol, 4, 1-16, DOI: 10.1089/aivt.2017.0034

Publikationsdatum: 05.07.2019

Fakten, Hintergründe, Dossiers

  • Lungentoxizität
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  • Luftqualität
  • Verbrennungsaerosole

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    Dipl. Ing. Sonja Mülhopt

    Sonja Mülhopt erwarb 2000 ihr Diplom für Maschinenbau an der Berufsakademie (heute DHBW) Mannheim. Die begleitende Ausbildung durchlief sie am Forschungszentrum Karlsruhe, dem heutigen Karlsruher Institut für Technologie (KIT). 2014 erhielt sie den Master of Science für Chemieingenieurwesen ... mehr

    Dr. Hanns-Rudolf Paur

    Hanns-R. Paur hat als Chemiker an der LMU in München promoviert und war dann als Postdoc an der UC Riverside in Kalifornien. Aktivitäten Von 1997 bis 2018 leitete er die Abteilung Aerosol- und Partikeltechnologie im Institut für Technische Chemie (ITC) des Karlsruher Instituts für Technolog ... mehr

    Prof. Dr. Stefan Bräse

    Stefan Bräse, geb. 1967, studierte Chemie in Göttingen und promovierte dort 1995 an der Universität. Nach Postdoktoraten in Uppsala/S und La Jolla/USA begann er an der RWTH ­Aachen mit seinen eigenständigen Arbeiten (Habilitation in organischer Chemie 2001) und wechselte 2001 als Professor ... mehr

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