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Die quantitative Visualisierung der Verteilung von Metaboliten hat in der Medizin und Biologie zahlreiche Anwendungen gefunden, ist jedoch nach wie vor eine schwierige analytische Herausforderung. Eine neuartige Methode zur Sichtbarmachung von Zucker in Pflanzen, die auf den Grundsätzen der Infrarotspektroskopie basiert und am IPK Gatersleben entwickelt wurde, ermöglicht die quantitative Saccharose-Visualisierung in mikroskopischer Auflösung. Sie bildet die Zuckerkonzentration in den einzelnen Leitbündeln und innerhalb komplexer Organe ab. Die Methode ist geeignet, um die Heterogenität im Stoffwechsel eines komplexen Organs zu charakterisieren und eröffnet so neue Wege zur Analyse der inneren Prozesse von Pflanzen.
Pflanzen transportieren Assimilate größtenteils in Form von Saccharose [1]. Das Disaccharid wird primär als Energiequelle, aber auch als Signalgeber in verschiedenen adaptiven und stressbedingten Reaktionen verwendet. Daher könnte die Möglichkeit, Saccharose über Zeit und Raum zu quantifizieren, einen Beitrag dazu leisten, unser Verständnis dieser wichtigen Prozesse zu verbessern. Bestehende Verfahren zur Saccharose-Kartierung sind überall dort unbefriedigend, wo die Verteilung innerhalb eines Gewebes quantitativ visualisiert werden soll. Leistungsfähige Technologien, wie die Massenspektrometrie [2] und die Positronenemissionstomographie [3], konnten für Saccharose bisher keine ausreichende chemische oder räumliche Auflösung erzielen. Die Kernspinresonanz kann zwar Saccharose in vivo markierungsfrei messen, kommt aber an ihre Grenzen, wenn der Zucker in geringer Konzentration vorliegt [4]. Die Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Methode erreicht prinzipiell eine hohe Auflösung [5], ihre praktische Nutzbarkeit im Zusammenhang mit Kulturpflanzen ist jedoch fraglich, da diese genetisch modifiziert sein müssten. Die bildgebende Detektion von Einzelphotonen, die als erste Methode Saccharosegradienten in Geweben darstellen konnte, und die quantitative Biolumineszenz sind dadurch eingeschränkt, dass kein angemessener Probendurchsatz möglich ist [6].
Wahl der FTIR-Mikrospektroskopie für die Zucker-Visualisierung
Die Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) hat in der medizinischen Forschung, Bakteriologie, Pflanzenzüchtung und Lebensmittelwissenschaft breite Anwendung gefunden, wurde jedoch bisher nicht auf die Darstellung von Saccharose oder anderen relevanten Zuckern angewendet. Ihre Verwendung für die quantitative Analyse von Gewebeschnitten ist im Wesentlichen durch die Komplexität der resultierenden Spektralmatrix beeinträchtigt. Diese lässt die spezifischen Signaturen von Metaboliten nicht erkennen und erfordert daher eine algorithmische Aufschlüsselung, um ein für den Metaboliten spezifisches Signal zu extrahieren. Außerdem fehlen geeignete Mittel zur Standardisierung des Analyseverfahrens und zur quantitativen Reproduktion der Daten. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir neue Algorithmen mit interner und externer Standardisierung entwickelt. Das neue Bildgebungsverfahren ermöglicht die quantitative Visualisierung der Saccharoseverteilung in heterogenen Pflanzengeweben mit einer Auflösung von rund 12 µm und einem Konzentrationsbereich von 20 bis 1.000 mM.
Experimentelles Design für die Saccharose-Visualisierung in Gefrierschnitten von Geweben
Abb. 1 Schematische Übersicht der Methode zur Erfassung und Analyse von FTIR-Spektren. (A-C) Hauptschritte zur Visualisierung und Standardisierung; (D) Rohspektren der Proben von Gewebeschnitten, deren Grundlinien variieren; (E) modellierte Grundlinienartefakte nach vier Runden Grundlinienkorrektur; (F) grundlinienkorrigierte Spektren, die den chemischen Fingerabdruck der Probe und des internen Standards zeigen. Absn, pixel: normalisierte Absorption, Pixel; ci: Koeffizient der Verbindung i; cAbs, MMI: Membrankoeffizient; Absi: Spektrum der aufgereinigten Verbindung i; E: Rauschen.
Das Verfahren wurde kürzlich ausführlich beschrieben [7] und ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Die Gefrierschnitte des Gewebes werden auf einer Membran angeordnet, um das Gewebe zu stützen, während der individuelle spektrale Fingerabdruck erfasst wird. Letzterer ergibt einen internen Standard für das Verfahren, dessen Zuverlässigkeit experimentell überprüft werden konnte. Die starken Grundlinienverschiebungen, die in den Rohspektren enthalten sind, werden unter Verwendung eines Algorithmus zur Grundlinienkorrektur herausgerechnet. Dazu wird der spektrale Würfel durch einen k-Means-Algorithmus in kleinere Bereiche unterteilt. Jedem Bereich wird dann ein Datensatz hinzugefügt, der aus den Spektren der einschlägigen reinen Analyte (d.h. den externen Standards) abgeleitet ist. Nach der anschließenden Modellierung werden die Standards mit den unbearbeiteten Gegenproben verglichen, wodurch das Modell angepasst werden kann. Das Verfahren erzeugt eine Koeffizientenmatrix, die die Zusammensetzung jedes Probenspektrums aus den Modell-Merkmalen beschreibt. Um diese Merkmale quantitativ über verschiedene Proben hinweg zu vergleichen, werden die Matrixkoeffizienten anhand des internen Standards normalisiert.
Methodenvalidierung
Zunächst wurde ein In-silico-Datensatz für reine Saccharose berechnet und in eine Mischspektren-Matrix eingebettet, die aus einer Reihe zufälliger Standards gewonnen wurde. Hiermit wurde anschließend die Effektivität des Merkmalextraktionsverfahrens getestet. Die resultierenden saccharosespezifischen Bilder wurden mit einem R²-Wert von >0,9 reproduziert. Es gab kaum Interferenzen mit den Spektren, die von anderen in der Matrix enthaltenen Verbindungen stammen. Die experimentellen Daten und die kalkulierten Signalintensitäten waren eindeutig linear korreliert. Als nächstes wurde eine Saccharose-Verdünnungsreihe erstellt, um die Korrelation zwischen bekannten Konzentrationen und Absorptionswerten zu ermitteln: Die Parameter R² (>0,98) und RMSEP (0,036 pg/µm²) deuteten auf ein hohes Konfidenzniveau hin. Schließlich wurde das Gewebe, das zuvor mit FTIR abgebildet wurde, per Laser zerlegt und die resultierenden Fraktionen durch Ionenchromatographie auf ihren Saccharosegehalt hin untersucht. Die modellierten und experimentellen Datensätze erwiesen sich erneut als signifikant korreliert (R²>0,98). Daraus lässt sich schlussfolgern, dass das FTIR-Verfahren die quantitative Saccharoseverteilung sehr präzise wiedergibt.
Anwendung der Saccharose-Visualisierung zur Analyse von Pflanzengeweben
Abb. 2 Quantitative Kartierung der Saccharose- und Stärkeverteilung im Getreidekorn. Die Konzentrationen sind farbkodiert, wobei rot das Maximal- und blau das Minimalniveau der dargestellten Metabolite zeigt und die Höhe des Z-Profils die jeweiligen Quantitäten bildlich repräsentiert.
Wir haben die Eignung der neuen Methode zur Visualisierung der Saccharoseverteilung in den Getreiden Gerste und Weizen sowie der Modellpflanze Arabidopsis getestet. Beispielhaft wird die Saccharose-Visualisierung für das junge Getreidekorn in der wichtigsten Füllphase dargestellt. Die Saccharose-Kartierung in Abbildung 2 zeichnet sich durch einen ausgeprägten Gradienten aus. Hohe Konzentrationen sind im Ventralbereich des Getreidekorns zu sehen, wo Saccharose über das Hauptleitbündel angeliefert wird. Das Profil stimmt gut mit dem überein, was die 13C/1H-NMR-Bildgebung zur Ortung des wichtigsten Saccharose-Translokationswegs ermitteln konnte [4]. Die FTIR-Bilder zeigen die höchsten Konzentrationen innerhalb der Endosperm-Transferzellen, die in der Lage sind, Saccharose gegen einen Konzentrationsgradienten aktiv aufzunehmen. Von den Endosperm-Transferzellen aus wurde ein eher flacher Gradient in Richtung des peripheren Endosperms gefunden, in dem Saccharose zu Stärke umgewandelt wird, dem wichtigsten Speicherstoff des Getreidekorns. Daraus lässt sich schließen, dass die FTIR-Plattform die Verteilung von Saccharose in einer Auflösung bis hinunter auf Zellmaßstab abbilden und eine Saccharose-Kartierung erzeugen kann, die den Allokationsprozess innerhalb des Korns widerspiegelt.
Bemerkenswert ist, dass unser Visualisierungsansatz auf eine Reihe anderer Metabolite ausgedehnt werden kann, wie es die Darstellung der Stärke zeigt (Abb. 2). Die FTIR deckt auf, wo im Korn sich Stärke ansammelt, und zwar im Endosperm. Die quantitative Analyse der Stärkeverteilung kann dazu beitragen, Getreideertrag und -qualität biotechnologisch zu verbessern.
Zusammenfassung und Ausblick
Die Pionierleistung unseres Ansatzes besteht darin, eine spezifische und standardisierte Analyse der Saccharoseverteilung in einer komplexen biologischen Probe zu ermöglichen. Die Bildgebung geschieht markierungsfrei und ist auf jedes Gewebe anwendbar. Ihre chemische und räumliche Auflösung reicht aus, um den Saccharosegehalt in einzelnen Zelltypen innerhalb eines pflanzlichen Organs zu quantifizieren – zum Beispiel im Phloem unter beliebigen Wachstumsbedingungen. Die Anwendung auf Kultur- und Modellpflanzen unterstreicht das Potenzial der Methode zur Auflösung der räumlichen Verteilung von Metaboliten und Photosynthaten, die beide wichtig sind, um ertragreiche Getreidesorten zu entwickeln. Das FTIR-Verfahren verwendet Instrumente und Materialien, die in fast jedem Labor verfügbar sind, und kann daher vor Ort etabliert werden. Da das Potenzial nicht auf die Saccharose-Visualisierung beschränkt ist, sehen wir für die Zukunft eine Vielzahl von Anwendungen in der angewandten Forschung und der Grundlagenforschung.
Danksagungen
Wir danken S. Wagner, Dr. A. Muszynska und S. Herrmann für wertvolle Beiträge. Diese Arbeit wurde von der DFG (Förderkennzeichen BO 1917-1) unterstützt.
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Infobox
Das Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) ist eine gemeinnützige Forschungseinrichtung, Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft und eine international führende wissenschaftliche Einrichtung auf den Gebieten der Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung. Die Forschungsarbeiten und Serviceleistungen tragen substanziell zur Erhaltung, Erforschung und Nutzbarmachung der Kulturpflanzenvielfalt bei. Die Arbeitsgruppe Assimilatallokation und NMR (AAN) ist Teil der Abteilung Molekulare Genetik (Leiter Prof. Dr. T. Altmann). Ihr Ziel ist es, neue Erkenntnisse über das Zusammenwirken von Metabolittransport, Stoffwechsel und Samenbau zu erlangen und somit Grundlagen für die Verbesserung ertragsbezogener Eigenschaften von Kulturpflanzen zu legen.
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Kategorie: Pflanzengenetik | Saccharose-Kartierung
Literatur:
[1] Lalonde, S., Wipf, D., & Frommer, W.B. (2004) Transport mechanisms for organic forms of carbon and nitrogen between source and sink, Annual Review of Plant Biology 55, 341-372, DOI: 10.1146/annurev.arplant.55.031903.141758
[2] Boughton, B.A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., & Roessner, U. (2016) Mass spectrometry imaging for plant biology: a review, Phytochem Rev. 15, 445-488, DOI: 10.1007/s11101-015-9440-2
[3] Partelová, D., Kuglerová, K., Konotop, Y., Horník, M., Lesný, J., Gubišová, M., Gubiš, J., Kováč, P., & Matušíková, M. (2017) Imaging of photoassimilates transport in plant tissues by positron emission tomography, Nova Biotechnol Chim 16(1), 32-41, DOI: 10.1515/nbec-2017-0005
[4] Borisjuk, L., Rolletschek, H., & Neuberger, T. (2012) Surveying the plant´s world by magnetic resonance imaging, Plant Journal 70, 129-146, DOI: 10.1111/j.1365-313X.2012.04927.x
[5] Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., & Frommer, W.B. (2009) Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics, Methods Mol Biol. 553, 355–372, DOI: 10.1007/978-1-60327-563-7_19
[6] Borisjuk, L., Walenta, S., Rolletschek, H., Mueller‐Klieser, W., Wobus, U., & Weber, H. (2002) Spatial analysis of plant development: sucrose imaging within Vicia fabacotyledons reveals specific developmental patterns, Plant Journal 29, 521–530, DOI: 10.1046/j.1365-313x.2002.01222.x
[7] Gündel, A., Rolletschek, H., Wagner, S., Muszynska, A., Borisjuk, L. (2018) Micro imaging displays the sucrose landscape within and along its allocation pathways, Plant Physiol. 178, 1448-1460, DOI: 10.1104/pp.18.00947
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