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Vor allem technologische und analytische Fortschritte bringen die Forschung voran. Dies gilt im biomedizinischen Bereich insbesondere für das Gebiet der Lipidforschung, das jahrzehntelang durch das Fehlen geeigneter Analysemethoden zur Untersuchung der enormen Komplexität von Lipiden im menschlichen Körper behindert wurde. Jetzt beginnt die Ära der Lipidomik (engl. „Lipidomics“), die sich auf die gesamten Lipide in einer biologischen Probe bezieht. Sie zieht vielfältige Anwendungen in Grundlagenforschung, Biotechnologie und Biomedizin nach sich (den gegenwärtigen Stand zeigen die Meinungsartikel zur Lipidomik auf [1]).
Verglichen mit DNA oder Proteinen wurden Lipide lange als eine eher unattraktive Klasse von Biomolekülen betrachtet. Sie sind fettig, vielleicht sogar übelriechend und haben in der Öffentlichkeit einen ziemlich schlechten Ruf, denn „Fett schadet uns“, weil es mit Krankheiten und Leiden – trans-Fettsäuren, schlechtes Cholesterin, Fettleibigkeit und die damit verbundenen Beschwerden – in Zusammenhang steht. Auf der anderen Seite tragen Fette viel zum Geschmack in unseren Steaks bei oder weisen – auch kommerziell genutzte – gesundheitliche Vorteile als Nahrungsergänzungsmittel auf, wie die Omega-3-Fettsäuren. In der Tat sind Lipide eine chemisch extrem heterogene Klasse von Molekülen, die mengenmäßig von wenigen Molekülen pro Zelle bis hin zu einem Hauptbestandteil der Masse von spezialisierten Fettgeweben reichen. Und sie sind unverzichtbare Metabolite in allen Körperzellen: Spezielle Lipide bilden biologische Membranen, die die Zellen nach außen abgrenzen oder das Zellinnere in spezielle Kompartimente unterteilen. Lipide, die sich als Fetttröpfchen ablagern (möglicherweise im Überschuss am Bauch oder den Hüften), dienen als die effizienteste Art der chemischen Energiespeicherung im Körper. Die Energie zur Synthese von Lipiden kann bei Bedarf durch Abbau wieder als chemische Energie genutzt oder als Wärme freigesetzt werden. Unser Herzschlag wird hauptsächlich durch Energie aus der Fettverbrennung angetrieben.
Zu etwa 50 % aus Lipiden besteht auch unsere Gehirnmasse, die uns das Nachdenken ermöglicht – hoffentlich auch über die Bedeutung dieser Klasse von Biomolekülen!
Lipide definieren sich durch ihre Hydrophobie, sind also in organischen Lösungsmitteln löslich und in Wasser unlöslich. Diese eher vage Definition impliziert jedoch bereits einige technische Herausforderungen für die Lipidanalyse. Viele essentielle Lipide sind nicht ohne weiteres durch organische Lösungsmittel extrahierbar, und einige der Lipidzwischenprodukte sind sogar in Wasser löslich.
Abb. 1 Die Lipide sind eine sehr heterogene Klasse von Molekülen. Eine kleine Auswahl: Die Arachidonsäure ist eine Fettsäure und spielt als Signalmolekül eine wichtige Rolle; sie ist auch eine Vorstufe der Prostaglandine, die hormonähnliche Funktionen haben. Triacylglycerol (TAG) wird im allgemeinen Sprachgebrauch als „Fett“ bezeichnet. Es enthält drei Fettsäurereste und ist die effizienteste Speicherform von Stoffwechselenergie. Abhängig von der Art der Fettsäure (gesättigt oder ungesättigt) ist TAG entweder flüssig (z.B. Olivenöl) oder fest (z.B. Butter). Phosphatidylinosit (PI) ist ein Membranphospholipid. Cholesterin moduliert Membraneigenschaften. Cerebrosid ist ein zuckerhaltiges Lipid in Nerven- und Muskelzellen (Formeln der PubChem-Datenbank https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ entnommen).
Abbildung 1 zeigt – um deren chemische Heterogenität zu veranschaulichen – verschiedene Lipidmoleküle, darunter Cholesterin, Glycerolipide und Sphingolipide. Mehrere Lipidbiosynthesewege dienen als Ziele von Antibiotika (z. B. die Synthese von bakteriellen Fettsäuren) oder von pharmakologischen Wirkstoffen (z. B. die Sterolbiosynthese in Pilzen oder dem Menschen). Ein detailliertes Klassifizierungsschema für Lipide befindet sich auf der Lipid-MAPS-Website (https://www.lipidmaps.org/) [2]. Ein weiteres Haupthindernis für die quantitative Beschreibung des Lipidoms einer Zelle bzw. eines Gewebes ist, dass verschiedene Lipidklassen und -arten in extrem unterschiedlichen Mengen vorkommen: Funktionell essentielle Signalmoleküle sind unter Umständen nur in winzigen Mengen vorhanden, sodass Volumenlipide sie in der Analytik überlagern.
Die enorme Komplexität der Lipide und das Fehlen geeigneter analytischer Methoden zur Bewältigung dieser Komplexität waren die größten Hindernisse in der Lipidforschung – bis vor kurzem. In den letzten zehn Jahren hat es einen dramatischen Wandel gegeben: Die Verfügbarkeit der Massenspektrometrie auch außerhalb von Speziallabors hat inzwischen tiefe Einblicke in die Zehntausende von Lipidarten ermöglicht, aus denen das Lipidom besteht. Die Lipidomik wurde zu einer aufstrebenden Disziplin zur umfassenden Beschreibung des gesamten Lipidprofils einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus. Sie ist ein gut definierter und sich rasch ausbreitender Zweig der „OMICS“-Revolution, die die Erfassung und Charakterisierung der Gesamtheit von Genen („Genomik“), Proteinen („Proteomik“) oder Metaboliten („Metabolomik“) in einer biologischen Probe zum Ziel hat, um die „personalisierte Medizin“ voranzubringen. Besonders getrieben waren die technologischen Entwicklungen auf dem Gebiet der Lipidomik durch das Bedürfnis diejenigen molekularen Mechanismen zu verstehen, die zu Störungen im Lipidstoffwechsel führen. Solche Erkrankungen haben inzwischen pandemische Ausmaße angenommen, betreffen Hunderte Millionen Menschen weltweit und haben Lipide und die Lipidforschung in den Blickpunkt der biomedizinischen Forschung gerückt. Fettleibigkeit, Diabetes Typ 2, koronare Herzkrankheit und Arteriosklerose werden allgemein als lipidassoziierte Krankheiten angesehen, aber auch Alterung, Krebs und neurodegenerative Erkrankungen könnten auf Fehlregulationen des Lipidstoffwechsels zurückzuführen sein [3-5]. Mehrere internationale Konsortien gingen vor etwa 15 Jahren voran und unterstützten und koordinierten Lipidomik-Initiativen, wie LipidMAPS (https://www.lipidmaps.org/), die Lipidomics Expertise Platform (http://www.lipidomics-expertise.de/), Singapore Lipidomics Incubator SLING (https://sling.sg/) und die Lipid-Bank (http://lipidbank.jp/). In der Folge dieser bahnbrechenden Initiativen sind mehrere Metabolomik-Einrichtungen und auch Unternehmen entstanden, die Lipidomik-Dienstleistungen anbieten.
Die am weitesten verbreitete Methode in der Lipidomik beruht auf der Massenspektrometrie (MS) [6,7]: Lipide aus einer Probe werden in das Vakuum des Massenspektrometers injiziert, einer schwachen Ionisierung unterzogen (üblicherweise in einer Elektrospray-Konfiguration) und die Ionen aufgrund ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses (m/z) getrennt, bevor sie auf den Detektor treffen. Diese Trennung erfolgt typischerweise in einer Reihe von speziell abgestimmten, alternierenden Magnetfeldern („Quadrupol“). Außerdem können Ionenfallen benutzt werden, um bestimmte Ionen vor der Detektion auszuwählen und anzureichern. Um bessere Einblicke in Strukturmerkmale zu erhalten, lassen sich Ionen in sogenannten Kollisionszellen in charakteristische Fragmente aufspalten. Time-of-Flight (TOF)-Einstellungen erlauben es, die Identifizierung von Fragmenten anhand ihrer Flugzeiten im Massenspektrometer weiter zu verbessern [6,7].
Abb. 2 Massenspektrum einer Lipidprobe. Der vergrößerte Bereich zeigt einen kleinen Ausschnitt dieses Spektrums und veranschaulicht die hohe Massengenauigkeit, die eine klare Unterscheidung zwischen verschiedenen Lipidspezies ermöglicht.
Lipidomik-Ansätze können zielgerichtet (engl. „targeted“) oder nicht zielgerichtet (engl. „untargeted“) sein. In der zielgerichteten Variante wird ein gezielt ausgewähltes Spektrum von Lipidmolekülarten, die allesamt durch spezifische m/z-Werte definiert sind, für den Nachweis und die Quantifizierung verwendet, wobei Lipidarten weggelassen werden, die für die Untersuchung nicht relevant sind, um unerwünschtes Hintergrundrauschen zu vermeiden. Die ungezielte Variante versucht das gesamte Massenspektrum zu erfassen und ermöglicht so den Nachweis auch unbekannter Lipidmoleküle. Beide Ansätze haben hinsichtlich Analysezeit und Empfindlichkeit Vor- und Nachteile (Abb. 2).
Ein hoher Probendurchsatz wird mit dem Schrotschuss-Verfahren (engl. „shotgun approach“) erreicht, bei dem Lipidextrakte ohne vorherige chromatographische Auftrennung in das Massenspektrometer injiziert werden. Die Analyse dauert nur wenige Sekunden pro Probe, um entweder ein gezieltes oder ungezieltes Spektrum von Lipidarten abzudecken. Obwohl dieses Verfahren ziemlich schnell ist, wird es leicht durch eine große Anzahl und eine stark variierende Vielfalt von Lipidmolekülspezies überfordert. Messsignal-unterdrückende Matrixeffekte, die die Quantifizierung von Lipidspezies behindern, können verringert oder die Lipididentifizierung verbessert werden, wenn die Probe vor der MS-Analyse einer chromatographischen Trennung unterzogen wird. Diese Variante ist zwar „quantitativer“ als das Schrotschuss-Verfahren, verlängert aber die Analysedauer erheblich. Welchem dieser Verfahren, die sich typischerweise ergänzen, der Vorzug zu geben ist, sollte von der spezifischen Anwendung abhängig gemacht werden.
Die massenspektrometrische Analyse des Lipidoms hat sich zu einer nicht mehr wegzudenkenden Analytikmethode in der Grundlagenforschung entwickelt, um diejenigen Biosynthesewege und deren Regulation zu verstehen, die letztendlich die Zusammensetzung und Funktion von Lipiden in einer Zelle oder einem Organismus bestimmen. Die Steady-State-Analyse eines Lipidprofils unter definierten Umweltbedingungen, als Reaktion auf die Nährstoffzufuhr oder nach Mutationen oder pharmakologischen Eingriffen, ist die erste Stufe zur Charakterisierung der qualitativen und quantitativen Lipidzusammensetzung einer Zelle oder eines Gewebes. Je nach technischer Ausstattung und erforderlichem Detaillierungsgrad der Analyse kann sie auch mit einem automatisierten Hochgeschwindigkeits-Schrotschuss-Verfahren für eine hohe Anzahl von Proben durchgeführt werden. Eine Steady-State-Analyse befasst sich jedoch nicht mit der Dynamik des Lipidstoffwechsels, denn das erfordert komplexere Ansätze, wie beispielsweise die Verwendung von Substraten, die mit schweren Isotopen markiert sind (z. B. Glucose, Fettsäuren oder andere Lipidvorläufer mit 13C), sowie eine zeitabhängige Analyse deren metabolischen Umsetzung. Der charakteristische Massenversatz durch Einführung eines 13C-Isotops gegenüber dem vorherrschenden 12C-Isotop ermöglicht es, die metabolische Umsetzung des Substrats über die Zeit zu verfolgen und gibt Aufschluss über die Beziehung zwischen Vorstufe, Zwischenprodukt und Produkt. Solche Analysen sind jedoch weitgehend auf die Grundlagenforschung beschränkt und für Strategien mit hohem Durchsatz nicht ohne weiteres praktisch nutzbar.
Ein sich rasch entwickelndes, klinisches Forschungsgebiet ist die Entdeckung von Lipiden als mögliche Biomarker: Lipidomik-Ansätze erweisen sich als äußerst nützlich zur Identifizierung charakteristischer, krankheitsbezogener Veränderungen im Lipidprofil eines Patienten, z. B. im Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten. Ein gleichzeitig stattfindender, quantitativer Nachweis von Tausenden Arten von Lipidmolekülen kann somit die Grundlage bieten für eine frühzeitige Diagnose von Krankheiten, die möglicherweise nicht einmal in direktem Zusammenhang mit dem Lipidstoffwechsel stehen, jedoch bestimmte Veränderungen im Lipidom auslösen. Da Lipidprofile stark durch Ethnie, kulturellen Hintergrund, Essgewohnheiten, Alter und diverse anderen Faktoren beeinflusst werden, ist diese Suche nach Lipidbiomarkern für zuverlässige Diagnosen wie die Suche nach einer Nadel im Heuhaufen. Die letztendliche Voraussetzung für eine absolute Quantifizierung, nämlich die Daten weltweit und über verschiedene technische Plattformen hinweg vergleichbar zu machen, ist daher weiterhin eine große Herausforderung [1]. Darüber hinaus sind Datenverarbeitung und -auswertung ständige Diskussionsthemen und sich rasch entwickelnde Zweige der Lipidomik-Forschung [1,7]. Es sollte ferner beachtet werden, dass die Lipidomik nicht nur den analytischen Nachweis und die Quantifizierung von Lipiden durch Massenspektrometrie verfolgt, sondern vielmehr ein integrierter Ansatz ist. Dieser umfasst auch die Identifizierung von Genen und Proteinen, die auf verschiedene Weisen am Lipidstoffwechsel beteiligt sind, sowie deren Regulation und Interaktion. Zu diesen Zwecken kommt ein breites Spektrum an analytischen Instrumenten und Techniken zum Einsatz [7].
Warum gibt es diese enorme Heterogenität und Komplexität von Lipidmolekülen in der Zelle? Gibt es spezielle Funktionen, die mit dieser Diversität in Zusammenhang stehen? Die Lipidomik wird irgendwann einige dieser grundlegenden Fragen beantworten. Letztendlich hängt das Leben von der Funktion einer etwa 5 nm dicken Lipidschicht ab (= 5 Milliardstel Meter bzw. 100-mal dünner als die Wand einer Seifenblase), die eine Zelle als solche definiert und ihr Inneres vom außerhalb liegenden Gewebe trennt. Wir sollten besser hinsehen und auf unsere Lipide achten!
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Kategorie: Im Fokus: Lipidomics | Leitartikel
Literatur:
[1] Kohlwein, S.D. (2017) Opinion articles on lipidomics – A critical assessment of the state-of-the-art, Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids 1862(8): 729–730, DOI: 10.1016/j.bbalip.2017.05.009, and references therein
[2] Fahy, E., Subramaniam, S., Brown, H.A. et al. (2005) A comprehensive classification system for lipids, J. Lipid Res. 46 (5): 839–61, DOI: 10.1194/jlr.E400004-JLR200
[3] World Health Organization (WHO) (2018) Obesity and overweight. Fact sheet 311. http:www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/#
[4] GBD Obesity Collaborators, et al. (2017) Health effects of overweight and obesity in 195 countries over 25 years. N. Engl. J. Med., 377, 13–27
[5] Fanning, S., Haque, A., Imberdis, T., Baru, V., et al. (2019) Lipidomic Analysis of α-Synuclein Neurotoxicity Identifies Stearoyl CoA Desaturase as a Target for Parkinson Treatmentm, Mol Cell, pii: S1097-2765(18)30998-5, DOI: 10.1016/j.molcel.2018.11.028
[6] Harkewicz, R., Dennis, E.A. (2011) Applications of mass spectrometry to lipids and membranes, Annu Rev Biochem 80: 301–25, DOI: 10.1146/annurev-biochem-060409-092612
[7] Yang, K., Han, X. (2016) Lipidomics: Techniques, Applications, and Outcomes Related to Biomedical Sciences, Trends Biochem Sci, 41(11): 954–969, DOI: 10.1016/j.tibs.2016.08.010
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