DNA- und RNA-Aptamere sind hochaffine nukleotidbasierte Bindemoleküle und werden alternativ zu Antikörpern bereits vielfältig in den Bereichen Analytik, Diagnostik und Therapeutik eingesetzt. Die Generierung neuer Aptamere und der Aptamertransfer in industrienahe Applikationen eröffnen neue Potenziale für umfangreiche Anwendungsfelder.

Aptamere sind universelle Bindemoleküle

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Abb. 1 Anwendungsbereiche von Aptameren: Die Zielmoleküle von Aptameren kommen aus einem sehr breiten Spektrum. Sie eignen sich deshalb für den sehr vielfältigen Einsatz in verschiedenen Umwelt- und Nahrungsmittelanalysen, sowie in der Medizin für Diagnostik und Therapie.

Bei Aptameren (von lat. aptus, passend) handelt es sich um funktionelle Nukleinsäuremoleküle, welche ähnlich den Antikörpern ein Zielmolekül mit hoher Affinität und Spezifität binden können. Diese kurzen, einzelsträngigen DNA- oder RNA-Oligonukleotide (ca. 15–100 Nukleotide lang) besitzen die Fähigkeit mittels ihrer komplexen dreidimensionalen Struktur, welche auf elektrostatischen Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken und Basenstapelungen beruht, ein Zielmolekül passgenau nach dem sogenannten „Schlüssel-Schloss-Prinzip“ zu binden. Aus einem sehr breiten Spektrum an Zielmolekülen konnten bereits erfolgreich Aptamere sowohl gegen Ionen, niedermolekulare Verbindungen, Peptide und Proteine, als auch gegen ganze Viren, Bakterien und Zellen entwickelt werden [1]. Sie eignen sich deshalb für den sehr vielfältigen Einsatz in verschiedenen Umwelt- und Nahrungsmittelanalysen, sowie in der Medizin für Diagnostik und Therapie (Abb. 1).

Generierung von Aptameren mittels des SELEX-Verfahrens

Das am häufigsten eingesetzte Verfahren zur Aptamergewinnung ist der SELEX-Prozess (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) [2, 3], bei welchem es sich um eine gerichtete In-vitro-Selektion handelt.

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Abb. 2 Schematischer Ablauf des SELEX-Prozesses: Bei dieser gerichteten In-vitro-Selektion wird eine Nukleinsäurebibliothek (Startpool) mit einem Zielmolekül (target molecule) inkubiert. Zielmolekülbindende Sequenzen werden von den nichtbindenden Sequenzen separiert und erstere isoliert, vervielfältigt und als angereicherter einzelsträngiger Nukleinsäurepool in einer erneuten In-vitro-Selektionsrunde eingesetzt. Dieser iterative Prozess besteht meist aus 10–20 Selektionsrunden.

Die Isolierung der Aptamere erfolgt aus einer Zufallsbibliothek. Diese besteht aus einer randomisierten Abfolge der vier möglichen Nukleotide (A, T, G und C) über einen Bereich von 15 bis 100 Nukleotiden (N), welcher zusätzlich von zwei konservierten Bereichen (Primersequenzen) umschlossen wird und eine theoretische Diversität von N⁴ besitzt. Typischerweise werden Startbibliotheken von mindestens 10¹⁴ Sequenzvarianten für den Selektionsprozess eingesetzt. Im SELEX-Prozess wird ein Zielmolekül mit einer dieser Nukleinsäurebibliotheken inkubiert und die zielmolekülbindenden Sequenzen von den nichtbindenden Sequenzen durch zum Beispiel intensives Waschen separiert. Zielmolekülbindende Sequenzen werden isoliert, vervielfältigt und als angereicherter einzelsträngiger Nukleinsäurepool in einer erneuten In-vitro-Selektionsrunde eingesetzt. Dieser iterative Prozess besteht meist aus 10–20 Selektionsrunden (Abb. 2). Die Struktur und somit die Passgenauigkeit der Aptamere hängt dabei nicht nur von der Nukleinsäuresequenz, sondern auch von ihrer Umgebung, wie zum Beispiel der Temperatur, dem pH-Wert und der Ionenkonzentration des verwendeten Lösungsmittels ab. Das SELEX-Verfahren ermöglicht bereits während des Selektionsprozesses diese Faktoren entsprechend einer späteren Applikation anzupassen.

Automatisierung und Managing des Selektionsverfahrens

In der Vergangenheit wurden sehr vielfältige Variationen des SELEX-Verfahrens zum Einsatz von spezifischen Zielmolekülen und zur Automatisierung des Verfahrens entwickelt und evaluiert, wie zum Beispiel Affinitätschromatographie-, Kapillarelektrophorese-, Cell-, Capture- und Tissue-SELEX.

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Abb. 3 Magnetroboter Biosprint15 / Qiagen: Durch Immobilisierung eines Bindungspartners im SELEX-Prozess (Zielmolekül oder Nukleinsäurebibliothek) an eine feste Phase in Form von magnetischen Partikeln kann dieser mit Hilfe von Magnetstäben automatisiert zwischen verschiedenen Reaktionsgefäßen transferiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht eine deutlich beschleunigte und parallele In-vitro-Selektion von bis zu 15 Zielmolekülen.

Am Fraunhofer IZI-BB kommt vorzugsweise ein halbautomatisiertes Verfahren zum Einsatz, in welchem zusätzlich ein Managingverfahren integriert ist. Durch die Kopplung eines der Bindungspartner (Zielmolekül oder Nukleinsäurebibliothek) an magnetische Partikel über spezielle Linkermoleküle erfolgt die Separation von Zielmolekülbindern automatisiert mit Hilfe eines Magnetroboters (Abb. 3). Dieses Verfahren ermöglicht eine deutlich beschleunigte und parallele In-vitro-Selektion von bis zu 15 Zielmolekülen [4]. Zusätzlich wird einerseits die Anreicherung von Zielmolekülbindern via Polymerasekettenreaktion (PCR - polymerase chain reaction) und einem fluoreszenzbasierten Bindungsassay (FLAA - fluorescence dye-linked aptamer assay, [5]) und andererseits die Diversität angereicherter Nukleinsäurepools via Diversitätsassay (DANA - diversity assay for nucleic acids) überprüft. Die Überwachung des Selektionsverfahrens ermöglicht eine direkte variable Steuerung und Optimierung des Verfahrens durch Änderung diverser Verfahrensparameter. Die Selektionsstringenz wird dabei von Runde zu Runde durch z.B. intensives Waschen erhöht, um eine Anreicherung von Zielmolekülbindern und eine Reduktion der Diversität in den angereicherten Nukleinsäurepools zu erreichen. Der SELEX-Prozess erfolgt somit noch effizienter, schneller und kostengünstiger und besitzt eine erhöhte Erfolgsquote.

Aptameridentifizierung mittels Sequenzierung, Charakterisierung und Optimierung

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Abb. 4 Workflow der Aptamerentwicklung: Ausgehend von einem Zielmolekül (target) werden über die In-vitro-Selektion und Sequenzanalyse die Aptamere zunächst identifiziert und in unabhängigen Bindungsstudien hinsichtlich ihrer Affinität und Spezifität zum Zielmolekül charakterisiert. Anschließend besteht die Option, die Aptamere zu optimieren und zu modifizieren, um sie in unterschiedliche Anwendungsbereiche integrieren zu können. Die Synthese der Aptamere erfolgt mit chemischen Synthesizern einfach und kostengünstig mit hoher Reproduzierbarkeit.

Die Aptamerentwicklung besteht aus verschiedenen Phasenabschnitten (Abb. 4). Die einzelnen Sequenzen der final angereicherten zielmolekülbindenden Nukleinsäurepools werden durch Sequenzanalysen mittels NGS-Technologie (next generation sequencing) zunächst identifiziert und mit Hilfe bioinformatischer Tools analysiert. Anschließend werden ausgewählte Sequenzen in unabhängigen Bindungsstudien hinsichtlich ihrer Affinität und Spezifität zum Zielmolekül experimentell charakterisiert. Neben den bereits erwähnten fluoreszenzbasierten Bindungsassays (FLAA) werden dafür weitere diverse Methoden wie zum Beispiel die Oberflächenplasmonresonanz (SPR - surface plasmon resonance spectroscopy), Microscale Thermophorese (MST), elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA) oder auch Durchflusszytometrie (FACS - fluorescence-activated cell sorting) eingesetzt. Zusätzliche Optimierungen von identifizierten DNA- oder RNA-Aptameren kann durch Sequenzverkürzungen und/oder Sequenzmodifizierungen erfolgen. Chemische Modifizierungen können hierbei sowohl der Stabilisierung als auch der Funktionalisierung dienen. So ist es zum Beispiel möglich, Enzyme und Fluoreszenzmarkierungen für die Detektion oder auch funktionelle Gruppen für die Oberflächenimmobilisierung einzubringen. Durch diese Modifizierungen können die Aptamere anschließend in ganz unterschiedliche Anwendungsbereiche integriert werden.

Aptamere vs. Antikörper

Die Dissoziationskonstanten von Aptameren können im nano- bis picomolaren Konzentrationsbereich liegen. Damit bewegen sie sich im gleichen Bereich wie die Affinität von Antikörpern zu ihren Zielmolekülen, sind jedoch mit höchstens 30 kDa deutlich kleiner und können somit zum Beispiel dichter auf Oberflächen gebracht werden. Aptamere lassen sich außerdem mit chemischen Synthesizern einfach und kostengünstig mit hoher Reproduzierbarkeit synthetisieren, ohne dass dabei das von Antikörpern bekannte Risiko von Chargenvariationen besteht. Das breite Spektrum des möglichen Aptamereinsatzbereiches liegt auch an ihrer geringen Sensitivität gegenüber physikalischer und chemischer Degradierung. So können sie in einer Vielzahl verschiedener Puffersysteme eingesetzt werden. Im Falle einer Degradierung durch Strukturumwandlung ist es zudem möglich, sie durch thermische Regeneration stets in ihre funktionale dreidimensionale Struktur zurückzufalten.

Aptasensor  – die neue Biosensorgeneration

Das breite Zielmolekülspektrum und die damit verbundenen umfangreichen Anwendungsgebiete von Aptameren wurden in der Vergangenheit in zahlreichen Publikationen beschrieben und erste Umsetzungen zu innovativen Produkten am Markt sind zu beobachten [6]. Neben dem Einsatz in Streifentests und Multititerplattenassays ist insbesondere die erfolgreiche Entwicklung von aptamerbasierten Biosensoren, kurz Aptasensoren, zu erwähnen. Häufig wird das Aptamer dabei auf einer Sensoroberfläche immobilisiert und fungiert als Biorezeptor, der bei der Bindung an sein Zielmolekül eine Signaltransduktion auslöst. Bisher wurden bereits erfolgreich optische, massensensitive oder elektrochemische Systeme umgesetzt. Letztere wurden beispielsweise für die Detektion der Anthracycline Daunorubicin und dessen Hydroxyderivat Doxorubicin entwickelt. Diese karzinogen, mutagen und embryotoxisch wirkenden Substanzen werden weit verbreitet in der Krebstherapie eingesetzt, jedoch werden große Teile des Medikaments bei der Behandlung von Patienten nicht metabolisiert wieder ausgeschieden. Deshalb sind Nachweissysteme einerseits zur Konzentrationsüberwachung im Blut und anderseits zur Kontrolle in Trinkwasser wünschenswert. Mit Hilfe der Quadratwellenvoltametrie- (SWV) und der Impedanzspektroskopie- (EIS) Technologie konnten beide Anwendungen mittels eines hochaffinen Daunorubicin-Aptamers [7] realisiert werden, wobei letztere schon ein sensitives Detektionslimit von 28 nM Doxorubicin erreicht hat [8, 9]. Diese Beispiele zeigen bereits das enorme Potenzial von aptamerbasierten Biosensoren als kostengünstige Alternative zu anderen Nachweismethoden.

Fazit/Ausblick

Aptamere sind die Nachweismoleküle der nächsten Generation und schon jetzt aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften und ihrem nahezu unerschöpflichen Anwendungsspektrum in den Bereichen Analytik und Therapeutik eine echte Alternative zu Antikörpern. Neuere Verfahren zur Generierung von „expanded“ Aptameren aus unnatürlichen Bausteinen (SOMAmers, Clickmers, etc.) werden das Einsatzspektrum von Aptameren zukünftig in ganz neue Dimensionen befördern.

Danksagung

Die Erarbeitung der Ergebnisse wurde durch Projektförderungen des Landes Brandenburg, des BMWi und des BMBF möglich.

Literatur:
[1] Klussmann, S. (2006) The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications, Wiley-VCH Verlag, ISBN: 978-3-527-31059-3
[2] Ellington A. D., Szostak J. W. (1990) In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature, 346 (6287), 818–822
[3] Tuerk C., Gold, L. (1990) Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 249(4968), 505–510
[4] Wochner, A., Cech, B., Menger, M., Erdmann, V.A. et al. (2007) Semi-automated selection of DNA aptamers using magnetic particle handling, Biotechniques, 43(3), 344–353
[5] Wochner, A., Glökler, J. (2007) Nonradioactive fluorescence microtiter plate assay monitoring aptamer selections, Biotechniques, 42(5), 578, 580, 582
[6] Menger, M., Yarman, A., Erdőssy, J., Yildiz, H.B. et al (2016) MIPs and Aptamers for Recognition of Proteins in Biomimetic Sensing, Biosensors, 6(3)
[7] Wochner, A., Menger, M., Orgel, D., Cech, B. et al. (2008) A DNA aptamer with high affinity and specificity for therapeutic anthracyclines, Anal Biochem., 373(1), 34–42
[8] Bahner, N., Reich, P., Frense, D., Menger, M. et al. (2018) An aptamer-based biosensor for detection of doxorubicin by electrochemical impedance spectroscopy, Anal Bioanal Chem., 410(5), 1453–1462, Epub 2017 Dec 3
[9] Arroyo-Currás, N., Somerson, J., Vieira, PA., Ploense, K. et al. (2017) Real-time measurement of small molecules directly in awake, ambulatory animals, Proc Natl Acad Sci USA, 114(4), 645-650, Epub 2017 Jan 9