In den letzten 12 Monaten hat es rege Diskussionen bezüglich der Vorteile eines ­gravimetrischen Ansatzes bei der Vorbereitung von Proben gegeben <1–5>. ­Diese wurden von Branchenorganisationen anerkannt, beispielsweise von der ­United States Pharmacopeia (USP); die USP schlug im Pharmacopeial Forum (PF) ­September/Oktober 2012 vor, Unterkapitel <1251> „Weighing on an Analytical Balance“ ­zu aktualisieren.

full-screen

Tab. 1 Manuelle Vorbereitung von Proben – Wiederholbarkeit und Genauigkeit

Die Analytical Research and Development Group (AR&D) von Pfizer in Groton, USA hat sich dieses neuen Ansatzes zur Probenvorbereitung mithilfe eines neuartigen vollautomatischen gravimetrischen Probenvorbereitungssystems angenommen. In detaillierten Studien wurden die Unterschiede in der Probenvorbereitung und den Standards zwischen manuellen volumetrischen Verfahren und den neuen automatisierten gravimetrischen Methoden aufgezeigt.

In diesem Artikel werden die in zwei spezifischen, von der AR&D Group in Groton durchgeführten Versuchen erhaltenen Daten vorgestellt. In beiden Versuchen wurde die nicht patentgeschützte Substanz Koffein verwendet. Der erste Versuch konzentrierte sich auf die Wiederhol­

full-screen

Tab. 2 Automatisierte gravimetrische Vorbereitung von Proben – Wiederholbarkeit und Genauigkeit

barkeit und Genauigkeit der Probenvorbereitung. Der zweite Versuch war eine Linearitätsstudie. In beiden Versuchen wurden die Proben manuell mithilfe volumetrischer Kolben vorbereitet und mit einer neuen, vollautomatischen Methode verglichen, bei der die Proben in einem gravimetrischen Dosiersystem, dem Quantos QX1 von Mettler Toledo, vorbereitet wurden. Das QX1-Dosiersystem beinhaltet eine 6-fache Mikrowaage zum Wägen von Substanzen und Lösungsmitteln mit automatisiertem Wechsel von bis zu zehn Substanzdosierköpfen und fünf Lösungsmitteldosierköpfen.

Wiederholbarkeit und Genauigkeit

full-screen

Tab. 3 „Unbekannte“ Proben für die manuelle Linearitätsstudie

Beim ersten Versuch sollte die Wiederholbarkeit und Genauigkeit der manuellen Probenvorbereitung mit der der neuen, automatisierten gravimetrischen Methode verglichen werden.

Es wurden sechs gleiche Lösungen zubereitet. Dazu wurden 20 mg Koffein abgewogen und in einem volumetrischen Kolben mit einer Methanol-Wasser-Mischung im Verhältnis 30:70 auf 50 ml aufgefüllt. Diese Prozedur dauerte insgesamt 50 Minuten. Das Lösen/Mischen der Proben auf einem Rüttler nahm 15 Minuten davon in Anspruch, sodass die manuelle Arbeitszeit 35 Minuten an Mitarbeiterkapazität (MAK)

full-screen

Tab. 4 „Unbekannte“ Proben für die automatisierte gravimetrische Linearitätsstudie

entsprach – 5 min pro Probe, Wäge- und Lösevorgang, zuzüglich 5 min für die Vorbereitung des Verdünnungsmittels. Tabelle 1 zeigt die manuellen volumetrischen Daten. Die zentrale Kennzahl ist die relative Standardabweichung (RSD) dieser Proben von 1,67 % (Tab.1).

Tabelle 2 zeigt die äquivalenten, mit der automatisierten gravimetrischen Methode erzielten Daten. Es wurden sechs gleiche Lösungen zubereitet. Dazu wurden 5 mg Koffein abgewogen und mit 12,5 g des gleichen Verdünnungsmittels (Methanol/Wasser im Verhältnis 30:70) direkt in eine Ampulle gegeben. Diese Prozedur dauerte insgesamt 30 min; 10 min davon waren Vorbereitungszeit (z. B. Füllen und Montieren von Pulver-

full-screen

Abb. 1 Linearitätsdiagramm der Daten der automatisierten gravimetrischen Probenvorbereitung

und Flüssigdosierköpfen und Einstellen der Sequenz), weitere 20 min waren Laufzeit. Die RSD bei diesen Proben betrug 0,49 %. (Tab. 2)

Dieser Versuch hebt drei Vorteile der automatischen gravimetrischen Vorbereitung von Proben hervor: Es werden 75 % weniger an Substanz und Lösungsmittel gebraucht, um die Probenlösungen herzustellen; mehr als 70 % der Arbeitszeit wird bei der Probenvorbereitung eingespart, und vor allem erhöht sich die Genauigkeit um mehr als das Dreifache.

Linearitätsstudie

Der zweite Versuch war eine Linearitätsstudie. Um die manuellen Daten zu erhalten, wurden fünf verschiedene Konzentrationen von 0,2 bis 0,6 mg/ml in 100-ml-Kolben zubereitet. Dies dauerte 60 min. Die lineare Regressionsanalyse zeigte einen Korrelationskoeffizienten von 0,99473 (Abb. 1).

Fünf unbekannte Proben wurden mit Konzentrationen zwischen 0,3 und 0,5 mg/mL vorbereitet. Tabelle 3 zeigt die tatsächlich in die Lösung eingewägte Koffeinmenge (Wv) im Gegensatz zu der aus dem Vergleich mit dem Linearitätsdiagramm ermittelten Menge (Wa). Die Übereinstimmung dieser beiden Werte variiert zwischen 97 und 100 % (letzte Spalte).

Es wurde ein äquivalenter Versuch durchgeführt, um die automatisierten gravimetrischen Daten zu erhalten. Diesmal wurden die Lösungen in 10 g Lösungsmittel statt 100 ml Lösungsmittel zubereitet. Es dauerte 40 min, die Lösungen vorzubereiten (zuzüglich 5 min zur Einstellung der Sequenz). Bei diesem Versuch ergab die lineare Regressionsanalyse einen beinahe perfekten Korrelationskoeffizienten von 0,99998 (siehe Abb. 1).

Wie beim manuellen Versuch wurden fünf unbekannte Proben mit Konzentrationen zwischen 0,3 und 0,5 mg/g vorbereitet und die Masse der einzelnen Lösungen aufgezeichnet. Die letzte Spalte in der „Unbekannten“-Tabelle 4 zeigt, dass die tatsächlichen Koffeingewichte im Vergleich zu den ermittelten Koffeingewichten für die einzelnen unbekannten Proben jeweils zu 100 % übereinstimmten.

Die in der Linearitätsstudie ermittelten Daten zeigen die überragende Qualität der automatisierten gravimetrischen Methode: Es werden 90 % weniger Substanz und Lösungsmittel gebraucht; 25 % der Zeit werden eingespart, der Korrelationskoeffizient wird verbessert und die unbekannten Proben werden präzise identifiziert.

Praktische Vorteile der ­automatisierten gravimetrischen Probenvorbereitung

Die Genauigkeit der vorbereiteten Proben verbessert sich erheblich; dies wirkt sich automatisch positiv auf die Qualität der mit den Proben erzielten Analyseergebnisse aus. Die kürzere Arbeitszeit sowie die eingesparten Substanz- und Lösungsmittelmengen können sich erheblich auf die Laboreffizienz und die laufenden Kosten auswirken.

Danksagungen

Dank an Mengyu Wu, Wellesley College, Wellesley, MA für die Durchführung der Versuche im Rahmen eines Sommerpraktikums bei Pfizer

full-screen

Gang Xue, Associate Research Fellow, Pfizer ARD

„Die Probenvorbereitung ist von zentraler Bedeutung für den analytischen Arbeitsablauf. Wir sind stolz auf unsere Zusammenarbeit mit Mettler-Toledo an der Entwicklung und vorläufigen Bewertung von Quantos QX1. Bei einem gezielten automatisierten (gravimetrischen) Probenvorbereitungsansatz mit dem QX1 konnte eine verbesserte Genauigkeit, ein geringerer Substanz- und Lösungsmittelverbrauch und eine kürzere Arbeitszeit für Analysten im Vergleich zur manuellen Vorbereitung nachgewiesen werden. In unserer weiteren Arbeit mit dem System wollen wir herausfinden, wie und wo es routinemäßig am besten eingesetzt werden kann.“

Literatur:
[1] „One-click sample preparation“, Joanne Ratcliff, World Pharmaceutical Frontiers, März/April 2012, S. 77.
[2] „Innovations in Gravimetric Preparation of Analytical Solutions: Regulatory and Compendial Perspectives“, Gregory Martin, American Laboratory, Juni/Juli 2012
[3] „The benefits of automated gravimetric sample preparation“, Joanne Ratcliff & Jan Prochnow, q&more, März 2012.
[4] „Reducing Variability and Out-of-Specification Results by Implementing High Quality Gravimetric Sample Preparation (GSP)“, Charles Ray, Klaus Fritsch, Joanne Ratcliff, ISPE, Februar/März 2012.
[5] On-demand-Webinare auf www.mt.com/Q-webinars: „Recent USP changes: Regulatory and quality aspects of sample preparation“; „What’s the matter with Sample Prep? Novel approaches and solutions“; „Preventing costly out-of-specification investigations“.