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Workflow

ICH-Linearitätsstudien anhand von Automated Standard Preparation und UHPLC

Fraser McLeod (Dionex Softron GmbH)

Gemäß der „International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for ­Human Use“ (ICH) müssen als Teil einer Methodenvalidierungsstudie analytische Methoden auf ihre Linearität getestet werden. Der gängige Prozess hierfür sieht vor, für fünf verschiedene Kalibrierungsstufen ­Standards vorzubereiten und jeden einzelnen Standard dreimal zu injizieren. Der Konzentrationsbereich liegt dabei in der Regel zwischen 70 % bis 130 % der Nennkonzentration.

Abb. 1 Analyse von 5 Softdrink-Analyten in weniger als 5 Minuten

Die Statistik empfiehlt, jede Kalibrierungsstufe einzeln vorzubereiten. Dadurch werden potenzielle Fehlerquellen, wie z. B. fehlerhaftes Einwiegen eines der Standards, randomisiert. In der Regel wird hiervon jedoch abgesehen, da es sich um einen zeitauf­wändigen Prozess handelt. Stattdessen wird oft eine Stammlösung vorbereitet und diese anschließend auf die fünf unterschiedlichen Konzentrationsstufen verdünnt. Diese Methode hat den Vorteil der Schnelligkeit, sie hat jedoch auch einen gravierenden Nachteil: Jeder Fehler bei der Herstellung der Stammlösung überträgt sich auf die verdünnten Standards.

Viele chromatografische Methoden bestimmen mehr als einen Analyten, und jeder Analyt muss auf Line­arität geprüft werden. Hierdurch werden der Zeitaufwand (und die potenzielle Fehlerquote) der manuellen Vorbereitung und die Fehlerwahrscheinlichkeit bei Herstellung und Verdünnung der Stammlösung potenziert. Alle diese Strategien bringen also Nachteile mit sich.

Tab. 1 Konzentrationen der vom Quantos QB1-L-System vorbereiteten Softdrink-Analyte

Die Automatisierung der Standardvorbereitung mit dem neuen Quantos QB1-L-System von Mettler-Toledo stellt daher eine geeignetere Methode dar. Das System ermöglicht es, Analyten automatisch in HPLC-­Proben­flaschen oder Messkolben zu dosieren. Zur Herstellung einer gravimetrischen Lösung kann zudem die entsprechende Menge an Lösungsmittel eingewogen werden. Dieses Verfahren bietet für Linearitätsstudien viele Vorteile, der größte besteht jedoch darin, dass die Zeit kein kritischer Faktor mehr ist und ein statistisch korrekter Ansatz implementiert werden kann, bei dem jede Standardkonzentration einzeln angesetzt wird.

Im hier beispielhaft dargestellten Experiment wurde die Linearität von fünf typischen Analyten in Er­frischungsgetränken getestet. Es handelte sich dabei um Acesulfam-K, Saccharin, Koffein, Vanillin und Benzoe­säure. Das Quantos-System wog automatisch die korrekte Menge jedes Analyten und anschließend die korrekte Menge des Lösungsmittels (90:10 Wasser:Methanol) ein, um die in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen zu erreichen. Die zur Vor­bereitung dieser Standards benötigte Zeit betrug lediglich 50 Minuten. Im direkten Vergleich zur manuellen Vorbereitung (ca. 3 Stunden für die Stammlösungs-Strategie oder ca. 4 Stunden für die manuelle Verdünnung in Einzelschritten) handelt es sich hierbei also um eine deutliche Zeitersparnis.

Tab. 2 Korrelationskoeffizienten aller Analyten

Nach der Vorbereitung der Standardlösungen folgt die eigentliche Analyse. Bei Verwendung der klassischen HPLC-Technik kann dieser Vorgang ca. 30 Minuten pro Analysenlauf in Anspruch nehmen. Die Gesamtzeit für das Linearitätsexperiment summierte sich demnach auf 7,5 Stunden (5 Kalibrierungsstufen x 3 Injektionen pro Stufe x 30 Minuten). Diese Analysenzeit kann mit UHPLC deutlich reduziert werden. Abbildung 1 zeigt die chromatografische Analyse aller fünf Analyten. Alle Substanzen wurden in weniger als 4 Minuten getrennt, die Gesamtzeitan­alysenzeit beträgt ledig­-lich 5 Minuten, so dass alle Injektionen in nur 1,25 Stunden abgearbeitet werden können.


Diese Analyse wurde mit dem Dionex UltiMate® 3000 Basic Automated-System durchgeführt – einem vollständig UHPLC-kompatiblen System der Einsteiger­klasse. Das System unterstützt Drücke bis zu 620 bar bei Flussraten bis 10 mL/min und ist ideal für schnelle Routineanalysen. Eine weitere Beschleunigung des Analysenvorgangs kann mit dem UltiMate 3000 Rapid Separation LC-System erreicht werden, welches Drücke bis 1000 bar unterstützt.

Tab. 3 Benötigte Zeit zur Durchführung eines Linearitätsexperiments unter Verwendung des alten Prozesses und des neuen, automatisierten Prozesses

Sobald alle Daten erfasst wurden, müssen die Ergebnisse berechnet werden. Die ICH fordert einen Bericht mit den folgenden Werten: Korrelationskoeffizient, y-Achsenabschnitt, Steigung der Regressionsgeraden und Summe der Fehlerquadrate. Außerdem muss geprüft werden, ob der Korrelationskoeffizient innerhalb der erwarteten Grenzwerte der Methode liegt (i. d. R. >= 0,999). Diese Berechnungen können sehr zeitaufwändig sein. Einige Labors verwenden Excel-Arbeitsblätter zur Beschleunigung des Prozesses, jedoch kann auch diese Methode sehr viel Zeit kosten, da die Benutzer die Werte in der Regel manuell eintragen und diese anschließend von einer weiteren Person geprüft werden müssen. Für die Beispielanalyse würde die Verwendung einer Tabellenkalkulation und die damit verbundene anschließende Prüfung ca. 2 Stunden in Anspruch nehmen. Mit dem Chromeleon® Chromatografie-Datensystem von Dionex kann diese Aufgabe vollständig automatisiert werden und die Ergebnisse für alle Analyten werden im Handumdrehen berechnet. Der Benutzer muss lediglich die Peaks benennen und die jeweiligen Konzentrationen eingeben – ein Vorgang, der nur 5 Minuten in Anspruch nimmt. Abbildung 2 zeigt den automatisch erstellten Bericht für den Analyten „Saccharin“.

Abb. 2 Linearitätsbericht für Saccharin

Durch die kombinierte Verwendung der beiden Systeme konnten im Rahmen dieses Linearitäts­experiments hervorragende Ergebnisse erzielt werden (Tab. 2). Der R2-Wert liegt für alle Analyten über 0,999.

Darüber hinaus bietet die Automatisierung des Linearitäts-Workflows durch die Kombination des Quantos QB1-L-Systems mit dem UltiMate 3000-System und der Chromeleon-Software die Möglichkeit, deutliche Produktivitätsvorteile zu erreichen (Tab. 3).

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  • Autoren

    Dr. Mark Tracy

    Mark Tracy, studierte Chemie an der University of California, Davis, und erlangte 1984 seinen PhD. Nach dem Studium war er als Chemiker bei der U.S. Air Force, beim California Veterinary Diagnostic Laboratory System und bei Pickering Laboratories Inc. tätig. Seit 2001 arbeitet er für Dionex ... mehr

    Dr. Carsten Paul

    Carsten Paul, Jg. 1983, studierte Chemie (Umweltchemie) an der Friedrich-Schiller-Universität Jena von 2004 bis 2008. Nach kurzem ­Aufenthalt am Scripps Institute for Oceanography (La Jolla, CA, USA) promovierte er als Stipendiat der Jena School for Microbial Communication am Lehrstuhl für ... mehr

    Dr. Frank Steiner

    Frank Steiner, Jg. 1965, studierte Chemie und promovierte 1995 an der Universität des Saarlandes in Saarbrücken. Es folgte ein Postdoc- Aufenthalt am Centre d‘Études Nucléaires de Saclay in Frankreich, wo er sich mit Elementar- und Isotopenanalytik mittels IC und IC-ICP/MS beschäftigte. Ans ... mehr

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