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Extrazelluläre Vesikel als biogene Transporter für Antibiotika

Entwicklung neuer Wirkstoffträger nach den Prinzipien der Natur

Dr. Gregor Fuhrmann (Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung Saarland (HIPS), Nachwuchsgruppe Biogene Nanotherapeutika (BION))

Die Entwicklung neuer antimikrobieller Behandlungsstrategien ist eine zunehmende Herausforderung in der heutigen Gesundheitsforschung. Ein gezielter Transport von Wirkstoffen in bakteriell infiziertes menschliches Gewebe könnte die antibiotische Therapie schwer behandelbarer Keime signifikant verbessern. Die Nachwuchsgruppe Biogene Nanotherapeutika am Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung beschäftigt sich mit natürlich vorkommenden Nanopartikeln – extrazelluläre Vesikel – als mögliche natürliche Transportsysteme für Antibiotika.

Die aktuellen Herausforderungen in der Therapie bakterieller Infektionen

Bakterielle Infektionen sind eine zunehmende Herausforderung für die heutige Gesellschaft. In den vergangenen Jahrzehnten hat die Zahl resistenter und schwerbehandelbarer Keime stetig zugenommen. Daher hat die Bundesregierung der Bekämpfung solcher Bakterien mit ihrer Deutschen Antibiotika-Resistenzstrategie (DART 2020) höchste Priorität eingeräumt. Schätzungen zufolge sterben allein in Deutschland jedes Jahr bis zu 15.000 Menschen an Infektionen mit resistenten Bakterien [1]. Gleichzeitig sinkt die Zahl neu entwickelter antibiotischer Wirkstoffe, was die Dringlichkeit erhöht, vorhandene Medikamente effizienter zu machen. Ein vielversprechender Weg, die Effizienz von Antibiotika zu verbessern, besteht in deren Verkapselung in Wirkstoffträger, wie beispielsweise Nanopartikel. Diese Wirkstoffträger können Antibiotika gezielter zum Wirkort transportieren und so deren typischerweise auftretenden Nebenwirkungen, wie beispielsweise Diarrhöe oder Nierentoxizität, reduzieren. Gleichzeitig sollen die Nanopartikel spezifisch mit den Zielkeimen interagieren, ihre antimikrobielle Fracht freisetzen und so die antiinfektive Wirkung steigern [2].

Abb. 1 Wirkstoffträger nach dem Prinzip der Natur. Im Gegensatz zu rein synthetischen Wirkstoffträgern werden biogene Systeme aus der Natur isoliert oder nach Prinzipien der Natur verwendet. Diese Systeme können semisynthetisch modifiziert werden, um so die Interaktion mit Zielpathogenen zu optimieren. (Abbildung aus [4] mit Erlaubnis reproduziert, Copyright (2018) American Chemical Society.

Derzeit verwendete Wirkstoffträger sind meist auf Basis synthetischer Polymere oder Lipide hergestellt und es ist unklar, ob diese aufgrund ihrer künstlichen Herkunft für Langzeitanwendungen geeignet sind. Im Bereich des gezielten Wirkstofftransports zur Krebstherapie konnte beispielsweise gezeigt werden, dass der Körper nach wiederholter Gabe bestimmter nanopartikulärer Systeme Antikörper gegen diese produziert, die zu schnellem Abtransport und damit Wirkungsverlust führten [3]. Die Gruppe Biogene Nanotherapeutika (BION) am Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung Saarbrücken (HIPS) beschäftigt sich daher mit neuen, natürlich vorkommenden Wirkstoffträgern, die sowohl physiologisch verträglich sind als auch effizient bakterielle Infektionen bekämpfen (Abb. 1) [4].

Extrazelluläre Vesikel als natürliche Kommunikatoren

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind Nanopartikel, die unter physiologischen Bedingungen von Zellen produziert werden, um den Austausch von Signalmolekülen zwischen verschiedenen Zelltypen und Geweben zu bewirken. Fast alle bisher untersuchten Zellen produzieren EVs. Es wurde zudem gezeigt, dass je nach Mutterzelle manche EVs sehr selektiv mit einer Art von Zielzellen interagieren. Diese spezifische Interaktion macht EVs zu vielversprechenden Transportern, um Wirkstoffe gezielt zum Wirkort zu bringen. Im Gegensatz zu synthetischen Nanopartikeln besitzen EVs eine natürliche Zusammensetzung und daraus abgeleitet eine erhöhte Stabilität und bessere Biokompatibilität in physiologischer Umgebung [5]. Für eine effiziente antimikrobielle Therapie ist weiterhin vorteilhaft, dass EVs einiger Zellen an sich bereits eine antibakterielle Wirkung aufweisen. Wenn es gelingt, die natürlichen Eigenschaften von EVs mit der Wirkung etablierter Antibiotika zu kombinieren, könnten Nanocarrier erzeugt werden, die spezifisch Bakterien bekämpfen und damit neue Ansätze für antiinfektive Therapien bieten. Um EVs als Arzneistoffträger zu nutzen, sind allerdings grundlegende Methoden ihrer Gewinnung im größeren Maßstab, die Analyse ihrer Lagerstabilität und effektive Beladungsmethoden essentiell.

Stabilität der EVs unter verschiedenen Lagerbedingungen

Bei der Entwicklung von Nanoformulierungen spielt Lyophilisation (Gefriertrocknung) eine wichtige Rolle hinsichtlich ihrer Lagerung als Arzneimittel. Gefriergetrocknete Wirkstoffträger können ohne Kühlkette transportiert werden und bieten mehr Flexibilität beim verwendeten Suspensionsmedium. Zwar empfiehlt die International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) die Lagerung von EVs bei -80 °C, aber es ist einerseits unklar, ob dies am besten die biologische Aktivität der Vesikel bewahrt und andererseits verursacht es Zusatzkosten durch Geräte und Strom. Aus diesem Grund wurden EVs von verschiedenen Zelltypen isoliert und deren Stabilität unter diversen Lagerbedingungen – bei 4 °C, -80 °C, Raumtemperatur und nach Lyophilisation – untersucht [6]. Die Isolation der EVs erfolgte durch Ultrazentrifugation, gefolgt von einer Aufreinigung mittels Größenausschlusschromatographie. Dabei werden EVs von unlöslichen Proteinaggregaten getrennt, die die Analyse stören könnten. Eine kurzzeitige Lagerung von EVs führte bei keiner Bedingung zu einem wesentlichen Verlust an Partikeln oder einer Änderung deren mittlerer Größe, was auf eine inhärente Stabilität der EVs hinweisen könnte.

Abb. 2 Stabilität von EVs nach Lagerung. EVs wurden isoliert von mesenchymalen Stammzellen (MSC) oder A549-Epithelzellen und mit Glucuronidase beladen. (A) Bei 4 °C und -80 °C verlieren die in EVs verkapselten Enzyme während 30-tägiger Lagerung einen Großteil ihrer Aktivität. (B) Eine Gefriertrocknung ohne Zugabe von Kryoprotektoren führt zu einem vollständigen Aktivitätsverlust, der aber durch Zugabe von Trehalose umgekehrt werden kann. (Daten aus [6] mit Erlaubnis reproduziert, Nature Publishing Group)

Um eine biologisch relevante Aktivität der EVs zu bekommen, wurden diese mit dem Modellenzym Glucuronidase beladen. Die Beladungsstabilität konnte mit Hilfe der Asymmetrischen-Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung (AF4) studiert werden. AF4 ist eine Trennmethode für die Fraktionierung von Substanzen und kleiner Nanopartikel, die in einer Kammer ausschließlich durch verschiedene Längs- und Querflüsse erfolgt. Durch das Fehlen einer stationären Phase, mit der die Analyten interagieren, wird die AF4 als relativ milde Methode und für biologische Fragestellungen verwendet. Obwohl die Lyophilisation von enzymbeladenen EVs zu einem fast vollständigen Aktivitätsverlust der Glucuronidase führte, könnte dieser Effekt durch die Zugabe sogenannter Kryoprotektoren rückgängig gemacht werden (Abb. 2). Kryoprotektoren sind kleine Zucker- oder Polymermoleküle, beispielsweise Trehalose, die die EV-Membran beim Einfrieren vor schädlichen Eiskristallen schützen sollen und so deren Integrität verbessern. Tatsächlich führte die Zugabe von 1–4 % Trehalose zu den EVs zu einer Enzymaktivität, die mit der von glucuronidasebeladenen Liposomen als Positivkontrolle vergleichbar war. Diese grundlegenden Untersuchungen bilden eine wichtige Basis für die weitere Entwicklung von EVs als mögliche Wirkstoffträger.

Vesikel von Bakterien – biokompatibel und antibiotisch?

Abb. 3 Größe und Morphologie von zwei OMV-Arten isoliert von den Myxobakterien Cbv34 und SBSr073. (A) Kryoelektronenmikroskopie der OMVs zeigt deren typische Vesikelmorphologie. (B) und (C) zeigen die Größe und Größenverteilung der beiden OMVs. (Daten aus [9] mit Erlaubnis von reproduziert, Copyright (2018) Elsevier)

Nicht nur Säugerzellen produzieren EVs, auch Bakterien nutzen diese Nanotransporter, um Informationen innerhalb einer Kolonie oder mit Nachbarn auszutauschen. Diese sogenannten äußeren Membranvesikel (outer membrane vesicles, OMVs) werden von gramnegativen Bakterien abgeschnürt und können unterschiedliche (patho)physiologische Rollen spielen. So ist bekannt, dass Pathogene diese nutzen, um Resistenzgene zu übertragen oder Wirtszellen zu manipulieren [7]. OMVs solcher Bakterien sind allerdings nicht als Wirkstoffträger geeignet, da sie selbst virulent wären. Myxobakterien sind eine Gruppe von Erdbakterien, die Schwärmverhalten zeigen und andere Keime im Kampf um biologische Nischen angreifen können. Gleichzeitig sind sie aber nicht pathogen für Menschen und sind Produzenten einer Vielzahl antibiotischer Naturstoffe [8]. Würden diese Antibiotika von den Myxobakterien direkt in die OMVs geladen, hätte man einen fertigen Wirkstoffträger [9]. OMVs von zwei repräsentativen Myxostämmen – Cbv34 und SBSr073 – wurden isoliert und deren Größe und Morphologie mittels Kryoelektronenmikroskopie analysiert (Abb. 3).

Abb. 4 Antibakterielle Aktivität von OMVs gegen E.coli-Modellbakterien. (A) OMVs von Cbv34 zeigen eine bakterizide Wirkung, während SBSr073-OMVs nur schwach bakteriostatisch sind. Gentamicin und PBS-Puffer wurden als Positiv- bzw. Negativkontrolle verwendet. (B) Kolonieformende Einheiten (CFU) nach Inkubation von E. coli mit verschiedenen Konzentrationen von OMVs, (C) deren antibiotische Aktivität dosisabhängig ist. (Daten aus [9] mit Erlaubnis reproduziert, Copyright (2018) Elsevier)

Im Vergleich zu Säugervesikeln zeigten die OMVs zwar eine kleinere Größe von ca. 150 nm, waren nach Lyophilisation aber stabil auch ohne die Zugabe von Kryoprotektoren. Für die mögliche Anwendung am Patienten sollten Nanotransporter möglichst biokompatibel sein und nicht das Immunsystem stimulieren. Interessanterweise zeigten beide OMV-Arten keinen negativen Einfluss auf A549-Epithelzellen und THP-1-Makrophagen. Diese In-vitro-Assays sind zwar sehr einfache Tests, die nicht die Komplexität im lebenden Organismus abbilden, aber sie geben einen ersten Hinweis auf eine mögliche gute Verträglichkeit der OMVs. Um den antimikrobiellen Effekt der OMVs zu untersuchen wurde deren wachstumshemmende Wirkung auf E. coli-Modellbakterien untersucht (Abb. 4). Es zeigte sich, dass SBSr073-OMVs nur leicht bakteriostatisch wirken, während die OMVs von Cbv34 dosisabhängig vollständig bakteriostatisch wirkten. Diese Wirkung wurde von einem Naturstoff namens Cystobactamid 919-1 hervorgerufen, der in diesen OMVs mittels Massenspektroskopie identifiziert werden konnte. Cystobactamide sind effiziente Inhibitoren der bakteriellen Topoisomerase, einem Enzym, das für die Spiralisierung von DNA verantwortlich ist [10]. Leider konnte keine Quantifizierung der Wirkstoffmenge pro OMV durchgeführt werden, da das Hintergrundsignal der Vesikellipide im Massenspektrogramm zu prominent war. Eine tiefergehende Analyse des antibiotischen Wirkprinzips und der Frage, ob man Myxobakterien so kultivieren könnte, dass Sie mehr OMVs mit mehr Cystobactamid erzeugten, sind für die Zukunft vorgesehen.         

Fazit und Ausblick

EVs besitzen diverse Eigenschaften, die sie für einen therapeutischen Einsatz prädestinieren. Die hier vorgestellten Arbeiten zu deren Charakterisierung bilden eine notwendige Grundlage, um diese natürlichen Vesikel besser zu verstehen. Schon durch die Verwendung kleiner Fermenter anstelle von Kulturkolben im Labormaßstab könnten OMV-produzierende Bakterien in größerer Menge gezüchtet werden. Es bleibt aber weiterhin zu untersuchen, ob die antibiotischen Vesikel auch klinisch relevante Pathogene abtöten und wie sie mit nützlichen Bakterien, beispielsweise jenen der Darmflora interagieren. Eine Analyse in komplexeren In-vitro-Zellmodellen und in geeigneten Tiermodellen ist hier notwendig. Auch eine Kombination der natürlichen Eigenschaften der Vesikel mit intelligenten Biomaterialien wäre denkbar und würde ihre Anwendbarkeit erweitern [11]. Die komplette Beseitigung eines Infektionsherdes ist eine große Herausforderung und zudem dringend notwendig um die Entstehung neuer Resistenzen zu verhindern. Biokompatible und inhärent antibiotische Vesikel könnten einen wichtigen Beitrag zum Erreichen dieses Ziels leisten.

Danksagung

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das NanoMatFutur-Programm des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (Förderkennzeichen 13XP5029A).

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Infobox

Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung Saarland (HIPS)

Das Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung Saarland in Saarbrücken ist eine Außenstelle des Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung in Braunschweig. Das HIPS wurde 2009 gegründet und beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer antiinfektiver Wirkstoffe und Therapiestrategien. Als erstes Forschungsinstitut in Deutschland, das ausschließlich der pharmazeutischen Forschung gewidmet ist, hat das HIPS die Translation wissenschaftlicher Ergebnisse in therapierelevante Anwendungen zum Ziel. Der Forschungsschwerpunkt liegt dabei auf der Isolation von antimikrobiellen Naturstoffen, dem synthetischen Wirkstoffdesign und der Entwicklung von modernen Wirkstoffträgern. Die Aktivitäten am HIPS sind eng verknüpft mit der Universität des Saarlandes.

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Literatur:
[1] Gastmeier, P., Geffers, C. (2008) Nosokomiale Infektionen in Deutschland: Wie viele gibt es wirklich? Dtsch Med Wochenschr 133, 1111–1115, DOI: 10.1055/s-2008-1077224
[2] Huh, A.J., Kwon, Y.J. (2011) “Nanoantibiotics”: A new paradigm for treating infectious diseases us-ing nanomaterials in the antibiotics resistant era, J Control Release 156, 128–145, DOI: 10.1016/j.jconrel.2011.07.002
[3] Bertrand, N., Leroux J.-C. (2012) The journey of a drug-carrier in the body: An anatomo-physiological perspective, J Control Release 161, 152–163, DOI: 10.1016/j.jconrel.2011.09.098
[4] Goes, A., Fuhrmann, G. (2018) Biogenic and biomimetic carriers as versatile transporters to treat infections, ACS Infect Dis, 4, 881–892, DOI: 10.1021/acsinfecdis.8b00030
[5] Pinheiro, A., Silva, A.M., Teixeira, J.H., Gonçalves, R.M. et al. (2018) Extracellular vesicles: intelligent delivery strategies for therapeutic applications, J Control Release 289, 56–69, 10.1016/j.jconrel.2018.09.019
[6] Frank, J., et al. (2018) Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports 8, 12377, 2018 Aug 17, DOI: 10.1038/s41598-018-30786-y
[7] Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R.L. (2015) Immune modulation by bacterial outer membrane vesi-cles, Nat Rev Immunol 15, 375-387, DOI: 10.1038/nri3837
[8] Hoffmann, T., Krug, D., Bozkurt, N., Duddela, S. et al. (2018) Correlating chemical diversity with tax-onomic distance for discovery of natural products in myxobacteria, Nature Communications 9, 803, 2018 Feb 23, DOI: 10.1038/s41467-018-03184-1
[9] Schulz, E., Goes, A., Garcia, R., Panter, F. et al. (2018) Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity, J Control Release 290, 46–55, DOI: 10.1016/j.jconrel.2018.09.030
[10] Baumann, S., Herrmann, J., Raju, R., Steinmetz, H. ,et al. (2014) Cystobactamids: Myxobacterial Topoisomerase Inhibitors Exhibiting Potent Antibacterial Activity, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53, 14605–14609, 2014 Dec 15, DOI: 10.1002/anie.201409964
[11] Fuhrmann, G., Chandrawati, R., Parmar, P.A., Keane, T.J. et al. (2018) Engineering Extracellular Vesicles with the Tools of Enzyme Prodrug Therapy. Adv. Mater. Weinheim 30, 1706616, DOI: 10.1002/adma.201706616

Publikationsdatum: 14.11.2018

Fakten, Hintergründe, Dossiers

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    Dr. Gregor Fuhrmann

    Gregor Fuhrmann, Jahrgang 1982, studierte an der Freien Universität Berlin Pharmazie und wurde 2013 in Pharmazeutischen Wissenschaften von der Eidgenössischen Technischen Hochschule (ETH) Zürich promoviert. Er absolvierte einen Postdoc-Aufenthalt am Imperial College London und ist seit 2016 ... mehr

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