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Alternativen zum Tierversuch?

Alternativen zum Tierversuch?

Kopplung von Elektrochemie (EC) und Massenspektrometrie (MS) für die Metabolismusforschung

Dr. Martin Vogel (Westfälische Wilhelms-Universität Münster, Institut für Pharmazeutische und Medizinische Chemie)

Die Aufklärung des Metabolismus potenzieller neuer Wirkstoffe ist eine der großen Herausforderungen in der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung. Sie ist in der Regel sehr zeitaufwändig und kostenintensiv. Klassische Ansätze basieren dabei im Wesentlichen auf In-vivo-Experimenten mit Labortieren ebenso wie auf In-vitro-­Untersuchungen mittels Leberzellen oder daraus gewonnenen Leberzellmikrosomen.

Im Gegensatz zu diesen etablierten Verfahren wird im Folgenden eine Methode präsen­tiert, die auf einem vollständig instru­mentellen Ansatz beruht. Hierbei wird in einer elektrochemischen Zelle der oxidative Metabolismus eines Wirkstoffes simuliert, und die erzeugten Produkte werden online in ein Massenspektrometer transferiert, mit dessen Hilfe die Identifizierung erfolgen kann.

Hintergrund

Im menschlichen Körper besteht einer der Hauptwege des Abbaus und der Eliminierung von Xenobiotika wie z. B. pharmazeutischen Wirkstoffen, Nahrungsmittelzusätzen oder Kosmetikinhaltsstoffen in einem anfänglichen enzymatischen Oxidationsschritt (Phase-I-Metabolismus: Funktionalisierung). Dieser wird durch Enzyme der Cytochrom-P450-Superfamilie (CYP) katalysiert. In einem zweiten Schritt folgt dann in der Regel eine Bindung der gebildeten – oftmals sehr reaktiven – Produkte an endogene nukleophile Abfangreagenzien wie z. B. an das Tripeptid Glutathion oder an Proteine (Phase-II-Metabolismus: Konju­gation). Dieser Metabolismusschritt wird vor allem durch Transferasen katalysiert. Das Endziel dieser körpereigenen Reaktions­kaskade ist schließlich die Ausscheidung der Xenobiotika, die zumeist über die Nieren erfolgt.

Heute basieren etablierte Methoden zur In-vitro-Simulation des oxidativen Phase-I-Metabolismus, um den es in diesem Artikel zuvorderst gehen soll, auf dem Einsatz von CYP-Enzymen der Leber. Diese werden entweder in Form einer perfundierten Tierleber, von Leberschnitten, von Leberzellen oder – dies ist am gebräuchlichsten – von Leberzellmikrosomen eingesetzt. Obschon diese Methoden die In-vivo-Bedingungen in guter Näherung abzubilden vermögen, sind doch die Nachteile hierbei, dass sie allesamt auf Tierversuchen basieren sowie mühsam und zeitaufwändig sind. Nachteilig ist zudem, dass viele Metabolite sehr reaktiv sind, und nicht in ihrer freien Form sondern nur als Konjugate mit Bestandteilen z. B. des Mikrosomenansatzes detektiert werden kommen. Hinzu kommt, dass die Reproduzierbarkeit wie bei vielen biologischen Systemen nur eingeschränkt gegeben ist.

Vielen Synthesechemikern ist die Elektrochemie (EC) als etablierte Methode zur Durchführung von Oxidationsreaktionen ein Begriff. Es bietet sich daher an, die EC ebenfalls zur Simulation des oxidativen Phase-I-Metabolismus von Xenobiotika zu nutzen. Hierfür haben sich in den letzten Jahren insbesondere die folgenden beiden Ansätze etabliert: Zum einen kann eine elektrochemische Durchflusszelle direkt an ein Massenspektrometer gekoppelt werden (EC-MS) [1,2], zum anderen kann zwischen die elektrochemische Zelle und das Massen­spektrometer noch eine flüssigchromatografische (LC) Trennung geschaltet werden (EC-LC-MS; Abb. 1) [3,4]. In der Durchflusszelle werden die Ausgangssubstanzen bei einem konstanten Potenzial, das zuvor experimentell ermittelt wurde (siehe unten), oxidiert. Anschließend erfolgt entweder direkt oder nach Trennung die Detektion der Oxidationsprodukte im Massenspektro­meter. Mit den vielfältigen Experimenten und technischen Möglichkeiten der modernen Massenspektrometrie, z. B. Tandem-MS, Bestimmung der exakten Masse usw., kann die Identifizierung der Produkte erfolgen.

Während die direkte Kopplung von EC und MS insbesondere dann von Interesse ist, wenn sehr reaktive Metabolite, die z. B. in Mikrosomenansätzen mit ihren komplexen Matrices sofort weitereagieren würden, ohne signifikante Zeitverzögerung detektiert werden sollen, bietet sich die EC-LC-MS-Kopplung dann an, wenn komplexe Mischungen in der Durchflusszelle oxidiert werden. Somit wird – eine ideale LC-Trennung voraus­gesetzt – zu einem gegebenen Zeitpunkt jeweils nur das Reaktionsprodukt einer Einzelsubstanz detektiert. Zudem erlaubt die chromatografische Trennung – zumeist handelt es sich hierbei um Umkehrphasen (RP)-Trennungen – anhand der Elutions­reihenfolge Aussagen über die Polarität einzelner Produkte zu treffen und somit die Identifizierung zu erleichtern.

Abb. 1 Der Aufbau der Kopplung von elektrochemischer Durchflusszelle, flüssigchromatografischer Trennung und Massenspektrometrie (EC-LC-MS). Im Falle der reinen Kopplung von EC und MS ist der Auslass der EC-Zelle direkt mit dem Ionisationsinterface des Massenspektrometers verbunden.

Die elektrochemische Zelle

Heute werden die meisten Experimente zur elektrochemischen Simulation oxidativer Metabolismusvorgänge mit coulometrischen Durchflusszellen oder amperometrischen Dünnschichtzellen durchgeführt (Abb. 2). Beide Zelltypen bestehen aus ­einer Dreielektrodenanordnung aus Arbeits-, Refe­renz- und Gegenelektrode. Die gegenwärtig verwendete Arbeitselektrode der coulometrischen Zellen besteht typischerweise aus einer porösen Glaskohlenstoffelektrode oder Bor-dotiertem Diamant (BDD). Die amperometrische Dünnschichtzelle wird auch mit anderen Materialien für die Arbeits­elektrode wie z. B. Au, Ag, Pt, Cu eingesetzt. In Abhängigkeit vom Elektroden­material können dabei unterschiedliche Oxidationsprodukte erzielt werden, was u. a. auf Überspannungseffekte und die unterschiedliche chemische Reaktivität der Elektrodenmaterialien in verschiedenen Puffersystemen zurückzuführen ist.

Abb. 2 Aufbau einer coulometrischen Durchflusszelle (links) und einer amperometrischen Zelle (rechts). Beide Zelltypen bestehen aus einer Dreielektrodenanordnung. Das Potenzial wird zwischen Gegen- und Arbeitselektrode angelegt. Polarisationseffekte an der Gegenelektrode, die zu einem instabilen Arbeitspotenzial führen würden, werden durch die Verwendung einer Referenzelektrode, zumeist Palladium/Wasserstoff (Pd/H2), kompensiert.

Die Bedingungen der elektrochemischen Oxidation müssen für jeden Zelltyp und jede Applikation hinsichtlich des Oxidationspotenzials, des verwendeten Puffers und der Flussrate optimiert werden. Für die meisten Anwendungen wird ein physiologischer pH-Wert von 7,4 eingestellt. Für die Optimierung des Oxidationspotenzials ist es am einfachsten, ein so genanntes Massenvol­tammogramm aufzunehmen. Hierbei wird der Auslass der EC-Zelle direkt mit dem Ionisationsinterface des Massenspektro­meters verbunden. Die zu untersuchende Substanz wird dann kontinuierlich durch die Zelle gepumpt, wobei an diese eine Poten­zialrampe angelegt wird und das Massenspektrometer zeichnet fortlaufend Spektren auf. Die dreidimensionale Auftragung der Massenspektren gegen das angelegte Potenzial (Massenvoltammogramm, Abb. 3) erlaubt dann Aussagen über das Potenzial, bei dem unter den gegebenen Bedingungen wie Flussrate und Pufferzusammensetzung die meisten Oxidationsprodukte zu erwarten sind.

Abb. 3 Massenvoltammogramm von Anilin, das sensibilisierend auf die Haut wirkt und aus Azofarbstoffen in Kosmetika freigesetzt werden kann. Die Intensität des MS-Signals ist aufgetragen gegen das Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z, auf der x-Achse) und die angelegte Potenzialrampe (in mV, auf der z-Achse). Man erkennt, dass in diesem Fall bei steigendem Potenzial Oligomere des Anilins gebildet werden [6].

Validierung und Anwendungen

Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass CYP450-katalysierte Oxidationsreak­tionen und die elektrochemische Simula­tion dieser Reaktionen – obschon auf unter­schiedlichen Mechanismen beruhend – in weiten Teilen eine gute Übereinstimmung zeigen. Hierfür wurde eine Vielzahl von Wirkstoffen wie das Muskelrelaxans Tetrazepam, das Schmerzmittel Paracetamol, das Neuroleptikum Clozapin oder der Beta­blocker Metoprolol, um nur einige Beispiele zu nennen, jeweils mittels EC und isolierten Human- bzw. Rattenlebermikrosomen untersucht. Mit Ausnahme von Expoxidierungen sowie der Alkohol/Aldehyd-Oxi­dation konnten beim Vergleich zwischen EC und Mikrosomen die folgenden Reak­tionen erfolgreich elektrochemisch simuliert werden:

  • aliphatische, allylische, aromatische und benzylische Hydroxylierungen,
  • N, O- und S-Dealkylierungen,
  • N- und S-Oxidbildungen und
  • Dehydrogenierungen.

Auch die Umsatzraten von Mikrosomen- bzw. EC-Ansatz sind in den vergangenen Jahren genauer untersucht und verglichen worden. Hierbei hat sich gezeigt, dass diese von Substanz zu Substanz stark variieren. Während die elektrochemische Oxidation, wie oben erwähnt, signifikant von den ­experimentellen Bedingungen wie Fluss­rate oder Pufferzusammensetzung abhängt, zeigen Mikrosomenexperimente eine starke Abhängigkeit von der Expression der unter­schiedlichen Isoformen von CYP450-Enzymen. Daher ist ein quantitativer Vergleich beider Methoden bislang nur eingeschränkt möglich.

Insbesondere bei der Detektion reaktiver Metabolite hat sich die EC-LC-MS-Kopplung bereits als schnelles und einfaches Werkzeug erwiesen. In konventionellen Ansätzen können reaktive Metabolite nicht direkt detektiert werden, da sie rasch an Proteine binden. Diese kovalente Proteinbindung ist mit ein Grund dafür, dass ­toxische Effekte beobachtet werden. Die reaktiven Spezies werden daher indirekt detektiert. Hierzu wird ein Abfangreagenz – z. B. Gluta­thion – hinzugegeben. Erst anschließend ist der Metabolit einer Detek­tion und even­tuellen Identifizierung zugänglich. Am Beispiel des Antimalariamittels Amodiaquin konnte gezeigt werden, dass der EC-LC-MS-Ansatz eine gute Alternative zum in­direkten Detektionsansatz darstellt.

Darüber hinaus kann die elektro­chemische Oxidation genutzt werden, um auch die Bindung reaktiver Metabolite an Proteine gezielt zu untersuchen. Hierbei wird die zu untersuchende Substanz wie gewohnt in der EC-Zelle oxidiert. Nach der Zelle wird über eine Spritzenpumpe die Lösung des Proteins in eine Reaktionsschleife gegeben, sodass die potenziell gebildeten reaktiven Metabolite die Möglichkeit zur Konjugation erhalten. Die gebildeten Konjugate können dann im MS detektiert und die Bindungsstellen im Protein durch weitere Experimente bestimmt werden [5].

Die Online-Kopplung von Elektrochemie und Massenspektrometrie, in Abhängigkeit von der jeweiligen Applikation ergänzt durch eine flüssig chromatografische Trennung, hat sich, wie die Beispiele gezeigt haben, in den vergangenen Jahren zunehmend als eine wertvolle Ergänzung zu herkömmlichen Untersuchungen von Metabolismusvorgängen erwiesen. Sie wird klassische Mikrosomenexperimente und andere etablierte Methoden auch in Zukunft nicht ersetzen können. Dennoch ist die EC-MS eine Methode, die ohne Tierversuche in der Lage ist, die wesentlichen Grundzüge des Phase-I-Metabolismus in schneller und unkomplizierter Weise vorherzusagen.

Literatur:
[1] Hambitzer, G. & Heitbaum, J. (1986) Anal. Chem. 58,1067–1070
[2] Zhou, F. & van Berkel, G.J. (1996) Anal. Chem. 67, 3643–3649
[3] Lohmann, W. & Karst, U. (2007) Anal. Chem. 79, 6831–6839.
[4] Baumann, A. & Karst, U. (2010) Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 6, 715–731
[5] Faber, H. et al. (2012) Anal. Bioanal. Chem. 403, 345–354
[6] Melles, D. et al. (2012) Anal. Bioanal. Chem. 403, 377–384

Erstveröffentlichung: Vogel, M., labor&more, 6.2013.

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    Martin Vogel, geb. 1973, hat Chemie studiert und an der Universität Münster in analytischer Chemie promoviert. Nach seiner Promotion ging er für einige Jahre an die Universität Twente in Enschede (Niederlande). Seit 2006 ist er wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Anorganische und ... mehr

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    Joachim Jose, geb. 1961, studierte Biologie an der Universität Saarbrücken, wo er promovierte. Die Habilitation erfolgte am Institut für Pharma­zeutische und Medizinische Chemie der Universität des Saarlandes. Von 2004 bis 2011 war Professor für Bioanalytik (C3) an der Heinrich-Heine-Univer ... mehr

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