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Supernova im ­Reagenzglas

Es wird die spannende Geschichte davon erzählt, wie es zur Erfindung ­einer Mega-Fluoreszenzverstärkung kam. Am Anfang stand die Frage: Wie kann man bisherige biochemische Nachweisreaktionen millionenfach verstärken, um dadurch biochemische „Nadeln im Heuhaufen“ ­(Substanzen in äußerst geringen Konzentrationen) in einem Vielkom­ponentensystem wie z. B. einer Blutprobe zu detektieren?

Eine Mega-Idee lieferte eine mögliche ­Lösung, die auf folgenden Gedanken ­basiert: Wird ein Nanokristall, bestehend aus Millionen von potenziell fluores­zie­renden Molekülen, anstelle eines oder ­einiger weniger singulärer fluoreszierender Moleküle als Label („Marker“) bei immunochemischen Antigen-Antikörpertests oder bei Hybridisierungsreaktionen (DNA-Tests) eingesetzt, so kann es rechnerisch zu einer potenziellen, millionenfach stärkeren Fluoreszenz und damit Verstärkung kommen. Wenn ein solcher Nanokristall schnell in Lösung gebracht und dann durch eine chemische Reaktion – eine Hydrolyse – zur Fluoreszenz getriggert wird, kommt es schlagartig zur Fluoreszenz von Millionen potenziell fluoreszierender Moleküle. Dies kann mit einer „Supernovaexplosion im All“ verglichen werden. Als fluoreszierendes Molekül wurde Fluoresceindiacetat (FDA), ein nicht fluoreszierendes organisches Molekül, das nach der Hydrolyse fluoresziert, gefunden und ausgewählt.

Das immer wieder auftretende Problem: mangelnde Nachweis- und Quantifizierbarkeit einer Substanz in einer komplexen Probenmatrix

Wo braucht man hochempfindliche Nachweisreagenzien?

Der Nachweis eines Analyten in Blut, Serum/Plasma, Urin, CSF oder Speichel kann sehr „mühsam und stressig“ oder bislang überhaupt nicht möglich sein – vor allem dann, wenn DNA, Antigene, Antikörper oder andere Stoffe nachgewiesen werden sollen, die in nur sehr geringen Konzentrationen (z. B. im Nano-, Pico- oder Femtogramm/mL-Bereich) vorliegen oder wenn es schwierig oder schmerzvoll ist, größere Mengen an Probenmaterial zu bekommen.

Mit heutigen Bestimmungsverfahren – unter Einsatz von kolloidalem Gold oder klassischen Fluoreszenzmarkern – ist es möglich, beim Einsatz von 50–100 µL Kapillarblut die kardialen Marker wie Troponin I/T, FABP oder BNP/NT-proBNP qualitativ und quantitativ zu bestimmen. Aber wie bekommt man 50 –100 µL Kapillarblut aus der Fingerbeere? Dies ist nicht schmerzlos. Bei Einsatz des Super-Labels FDA als Nanokristall reichen 5–10 µL Blut. Diese Menge an Blut ist problemlos zu erhalten.

Heureka im Nachtlabor

Die FDA-Story

Im Jahre 1999/2000 arbeitete Dieter Trau, derzeit Professor an der National University Singapure (NUS), an seiner Doktorarbeit an der Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) im Labor von Prof. Dr. Renneberg. Sein Forschungsbereich war die Layer-by-Layer-Einkapselung von verschiedenen Enzymen und Mikromolekülen mithilfe von Polyelektrolyten. Hierbei verwendete er unter anderem auch den organischen Stoff Fluoresceindiacetat (FDA), der kommerziell in kristalliner Form vorliegt.

© Ming Fai Chow

Als Dieter Trau das Polyelektrolyt-Labeling von großen FDA-Kristallen gelang, kam ihm eine Idee, wie er seine bisherigen Experimente direkt weiter nutzen könnte: „Wieso nicht einen fluoreszierenden Kris­tall für einen Fluoreszenznachweis anstelle der üblichen Nachweismethoden verwenden, bei denen nur wenige fluoreszierende Moleküle pro Antikörper binden?“

Dieter Trau labelte also klein gemahlene FDA-Kristalle zuerst mit Polyelektrolytschichten aus PAH (Polyallylamin-Hydrochlorid) und PSS (Polystyrensulfonat). Anschließend heftete er an diese Antikörper, um einen Immunotest auszuprobieren. Nach verschiedenen Tests und Experimenten gelang es ihm, erfolgreich einen FDA-Kristall zuerst mit Antikörpern zu labeln und anschließend Antigene zu binden. Zur Erzeugung des Signals fehlte aber letztendlich die Reaktion von nicht fluoreszierendem FDA zu stark fluoreszierendem Fluoreszein. Hierfür nutzte Trau zuallererst Enzyme (Esterasen), die auch in der Zellkultivierung verwendet werden. Diese führen die Reaktion jedoch nur relativ langsam durch, was den Effekt der starken Fluoreszenz wieder abschwächte. Weitere Versuche führten zur Hydrolyse der Acetatgruppen durch hochkonzentriertes Natriumhydroxid (NaOH) zu Essigsäure und Uranin (Abb. 1).

Abb. 1 Hydrolysereaktion von Fluoresceindiacetat (FDA) mit Natronlauge zum grün fluoreszierenden Uranin sowie Essigsäure als Nebenprodukt.

FDA ist jedoch eine organische Verbindung. Sie ist nicht gut wasserlöslich, aber sehr gut in organischen Lösungsmitteln wie DMSO oder IPA (Isopropanol-Alkohol) ­löslich. Mit Zugabe eines „Releasing Reagenses“, bestehend aus z. B. DMSO und Natriumhydroxid, „explodierten“ die Kris­talle wie bei einer Supernova und die komplette Flüssigkeit verfärbte sich schlagartig in eine stark grün fluoreszierende Lösung, die mit bloßem Auge zu erkennen ist (Abb. 2). Grundlage für die „Supernova-Fluoreszenz“ ist das sofortige Auflösen des Kristalls, was dann die schnelle chemische Reaktion zwischen der Natronlauge und dem FDA ermöglicht. Prof. Renneberg rief begeistert „Super“ und Dieter Trau ergänzte mit „und Neu ist nova“. So kam die Idee zu einem Namen – „SuperNova“ – und wurde kurze Zeit später auch patentiert [1].

„Wundersubstanz“ FDA

Illustration: Biotechnologie für Einsteiger, 4. Auflage

Abb. 2 Grafische Abbildung zur Veranschaulichung des Supernova-Prinzips, hier zum Nachweis von DNA: Zuerst kommt es zur Bindung von Fänger-DNA-Strängen an eine spezifische Oberfläche. Im nächsten Schritt bindet die gesuchte komplementäre DNA an den Fänger. Die nicht fluoreszierenden Nanokristalle wurden mit ergänzender Nachweis-DNA markiert und binden anschließend ebenso an den gefangenen DNA-Strang. Zuletzt wird das erforderliche Gemisch aus organischem Lösungsmittel (DMSO) sowie Reaktionsreagenz (NaOH) hinzugegeben. Der Kristall wird schlagartig aufgelöst und die vorerst nicht fluoreszierenden Moleküle fangen nach einer Folgereaktion an, grün zu strahlen.

Die Voraussetzungen: Es sollte eine Verbindung sein, die kristallin vorliegt, gut spezifiziert ist und als solche nicht fluoresziert. Der Kristall muss sich auf Nanometergröße klein mahlen oder umkristallisieren lassen. Warum aber ausgerechnet Kristalle? Sie bein­halten die dichteste Packung von Molekülen in der gesamten Natur. Nachdem der Kristall durch eine „Reaktionsmischung“ aufgelöst wurde, reagierten die gelösten Moleküle schlagartig weiter und alle gelösten Moleküle fluoreszierten. Dieter Trau gelang so in Hongkong erstmalig die Entdeckung von Fluoresceindiacetat (FDA) als Mega-Fluoreszenzverstärker [2].

Fluoresceindiacetat (FDA) ist ein Derivat des bekannten fluoreszierenden Moleküls Fluorescein, das oft in Immunoassays verwendet wird. Die beiden Stoffe unters­cheiden sich molekular durch zwei Acetatgruppen, die dem FDA angehängt sind. FDA selbst hat fast keine eigene Fluoreszenz und wird vorwiegend im Bereich der Bakterien- oder Zellkultivierung eingesetzt. Hierbei reagiert FDA mit hydrolysekatalysierenden Enzymen (speziell Esterasen) zu Fluorescein, indem die beiden Acetat­gruppen abgespalten werden. Dies spiegelt sich in einer intensiven grünlichen Färbung und Fluoreszenz wider, die sich mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops gut in den lebenden Zellen erkennen lässt. Mit dieser Reaktion kann zwischen lebenden und ­toten Zellen unterschieden werden, da abgestorbene Zellen keine Enzyme mehr produzieren.

Enormes Verstärkungspotenzial

Eine einzige, 100 nm große FDA-Kristall­kugel fasst sagenhafte 1.200.000 (1,2 Mio.) FDA-Moleküle. Bedenkt man nun, dass den rund 1,2 Mio. Molekülen im verwendeten Kristall bis zu zehn Moleküle gegenüberstehen, die direkt an Antikörper gebundenen sind, so kommt es zu einem Verhältnis von 1:120.000. Dies spiegelt sich natürlich auch in der Fluoreszenzstärke wider.

Kernfrage: Wie kann man ein besseres oder stärkeres Signal oder – genauer gesagt – ein höheres Signal/Noise-Verhältnis erzeugen? Wäre es nicht besser, anstelle von wenigen fluoreszierenden Molekülen von z. B. FITC einen Nanokristall von Millionen von FDA-Molekülen einzusetzen, um die analytische Sensitivität, charakterisiert durch die 3 NCCLS-Parameter – Nachweisgrenze, Bestimmungsgrenze und Quantifizierungsgrenze – in den ng/pg- bis fg-Bereich für geringe zur Verfügung stehende Probenmengen zu bringen?

Im Unterschied zu heutigen „State-of-the-art“-Vorgehen ist dies möglich, indem nicht nur Moleküle von Fluoreszenz-Labels an Antigene, Antikörper oder DNA gebunden werden, sondern Nanokristalle von fluoreszierenden Molekülen gebunden werden. Das heißt: Anstelle von etwa zehn fluoreszierenden Molekülen, die kovalent an Antikörper gebunden werden, kommt es bei der umgekehrten Bindungsfolge zur Verwendung eines kompletten Kristalls, bestehend aus einem Derivat eines fluoreszierenden Moleküls, an das die Antikörper direkt gebunden werden. Diese Bindung zwischen Kristall und Antigen oder Antikörper kann adsorptiven oder kovalenten Ursprungs sein. Die Bindungsstärke kann noch durch eine Vorbeschichtung des Kris­talls mit geladenen Polyelektrolytschichten, die so genannte Layer-by-Layer-Verkap­selung, erhöht werden [3].

Die große Herausforderung: Konkurrenz für die PCR?

Neben der Optimierung der Partikelgröße wird des Weiteren an der Entwicklung von Immunoassays für verschiedene Antigene und Antikörper gearbeitet, die eine geringere Nachweisgrenze als handelsübliche Assays haben [4]. Noch attraktiver wäre aber ein direkter Nachweis von nur wenigen DNA-Molekülen. Konkurrenzloser Standard ist derzeitig – neben mehreren anderen Amplifikationsverfahren – die Polymerasekettenreaktion, mit der man etwa 1 Mio. DNA-Kopien in einer Stunde erhält.

Wie nahe käme man mit der AmpCrys­tal (SuperNova)-Methode in den Bereich der DNA-PCR-Amplifiaktion? Wie viel DNA-Moleküle wären erforderlich, um diese zu detektieren? Was wäre mit SuperNova ohne Cycler und teure Enzyme möglich?

Das Vorgehen: Es wird ein Nanokristall nicht mit Antikörpern, sondern mit DNA-Einzelsträngen beschichtet. Diese binden an komplementäre DNA aus der Probe, die im ersten Schritt an eine Fänger-DNA gebunden wird. Nach der Zugabe des Releasing Reagenses und damit verbundener Mega-Fluoreszenzerzeugung kann diese nachgewiesen werden [5]. Man könnte die AmpCrystal-Methode auch mit PCR kombinieren und dadurch Zyklen einsparen – oder aber die PCR bei einigen Tests (z. B. in der Mikrobiologie) ersetzen.

Literatur:
[1] Dieter T. et al. (2004) US 20040014073
[2] Dieter. T. et al. (2002) Anal. Chem. 202, 74, 5480 –5486
[3] Frank C. et al. (2000) Langmuir, 16, 1485 –1488
[4] Chan C. et al. (2008) Adv Biochem Engin/Biotechnol 109:123–154
[5] Chan C. et al. (2007) Analytica Chimica Acta 584 7 –11

Erstveröffentlichung: Renneberg, R., Engels, J., Eisenwiener, H., labor&more, 6.2013.

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