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David gegen Goliath

David gegen Goliath

Entwicklung neuer antifungaler Wirkstoffe und Strategien

Dr. Dirk Müller-Hagen (Technische Universität Berlin), Prof. Dr. Vera Meyer (Technische Universität Berlin)

Wo der Laie nur ekligen Schimmel sieht, offenbart sich beim Blick durch das Mikroskop eine ganz besondere Welt der Ästhetik. Ein ­filigranes Netzwerk aus lang gestreckten und verzweigten Pilz­hyphen durchsetzt das Substrat, Lufthyphen erobern den Luftraum und bilden farbige Sporen, mit denen das gesamte Farbspektrum abgedeckt werden kann (Abb. 1). Wir Forscher sprechen daher ­lieber von Hyphenpilzen als von Schimmelpilzen.

Abb. 1 Der Lebenszyklus des Hyphenpilzes Aspergillus niger. Aus einer Spore entsteht ein junger Keimling (A), bei dem das Wachstum auf die Spitze beschränkt ist, sodass lang gezogene Zellfäden entstehen, die Hyphen. Diese verzweigen sich und bilden den Vegetationskörper, das Myzel (B). Wenn die Nährstoffe im Medium aufgebraucht sind, wird der Luftraum erobert – es bilden sich Lufthyphen, an deren Enden die vegetativen Sporen abgeschnürt werden (C). Ihre Farbe bestimmt unsere Farbwahrnehmung der Pilzkolonie, die wir dann mit bloßem Auge erkennen können. Im Falle von A. niger sind die Sporen braun-schwarz (D).

Hyphenpilze haben mittlerweile alle Bereiche menschlichen Lebens erobert. Als Lebensmittelproduzenten nutzen wir diese schon seit der Frühzeit. Als Edelschimmel im Schimmelkäse oder als Edelfäule bei der Herstellung hochwertiger Beerenauslesen sind sie unsere unverzichtbaren Begleiter. Eine immer bedeutendere Rolle spielen Hyphenpilze in der industriellen Produktion. Pilzliche Produktionsstämme finden sich in der großtechnischen Herstellung von Feinchemikalien, Proteinen und bioaktiven Wirkstoffen wie Enzymen und Antibiotika. Neuerdings machen sich Hyphenpilze auch als Fleischersatz einen Namen. Unter der Bezeichnung „Quorn“ steht dem Verbraucher ein proteinreicher und dabei fett- und cholesterinarmer Fleischersatz zur Verfügung.

Wo Licht ist, da ist auch Schatten. Befällt Botrytis cinerea bei trockenem, warmen Wetter die reife Weinbeere, so ermöglicht dies die Herstellung von hochwertigen Beerenauslesen. Erfolgt der Befall dagegen auf der unreifen Frucht, so ent­wickelt sich die Rohfäule mit erheblichen Ernteausfällen als Konsequenz.

Die Herausforderung

Pilzliche Infektionen sind generell auf dem Vormarsch. Sie entwickeln immer aus­geklügeltere Strategien, um die tödliche ­Wirkung von Fungiziden zu umgehen. Als Schädling in der Landwirtschaft führen sie zu Ausfällen, die nicht selten bis zu 50% einer gesamten Ernte betreffen können [1]. Nicht zuletzt ist auch der Mensch Ziel pilzlicher Infektionen, insbesondere invasive Mykosen lassen sich nur noch schwer thera­pieren. Die Verbreitung von Resis­tenzen gegen vorhandene Antimykotika, zumeist aus der Gruppe der Azole, resultiert in einer gestiegenen Mortalitätsrate. Zudem sind verfügbare Antibiotika oftmals von schweren Nebenwirkungen begleitet. Neue Anti­mykotika erreichen kaum noch die Marktreife. Es steht zu befürchten, dass wir den Wettlauf gegen pathogene Pilze verlieren werden.

Auf der Suche nach ­neuen ­antifungalen Wirkstoffen

Abb. 2 Dreidimensionale Struktur des AFP aus A. giganteus. Der amphipathische Charakter wird durch das Zusammenspiel einer kationischen und einer hydrophoben Domäne bestimmt. Die fünf antiparallelen ß-Sheets des Proteins sind durch lila Pfeile dargestellt.

Unsere Gruppe sucht nach biologischen Wirkstoffen, die spezifisch das Wachstum von Hyphenpilzen hemmen, jedoch für Mensch und Umwelt unbedenklich sind. Dabei interessiert uns nicht nur die Frage nach dem Wirkort und dem Wirk­mechanismus dieser Substanzen, sondern wir versuchen auch zu verstehen, welche Verteidigungsstrategien Hyphenpilze nutzen, um die tödliche Wirkung von Antimykotika zu umgehen. Wir gehen davon aus, dass uns die Kombination beider Fragestellungen ein umfassendes Verständnis antifungaler Überlebensstrategien liefert. Mit diesem Wissen können neue zelluläre Targets identifiziert oder vorhandene antifungale Substanzen optimiert werden. Um antifungale Verteidigungsstrategien zu untersuchen, bedienen wir uns eines antimikrobiellen Peptides (AMP), das wir aus dem Hyphenpilz Aspergillus giganteus gewinnen, dem Antifungalprotein AFP. AMPs sind Teil des natür­lichen Abwehrmechanismus aller lebenden Organismen und verfügen über ein breites antimikrobielles Spektrum. Sie wirken gegen Bakterien, Pilze und Viren und gehören zum antibiotischen Reservoir der Natur. Als positiv geladene, amphipathische Peptide haben sie eine Länge von nur sechs bis 100 Aminosäuren. Basierend auf ihrer Sekundärstruktur werden sie in vier Hauptgruppen eingeteilt: 1. β-Sheet, 2. α-helical, 3. loop und 4. extended protein. So verschieden ihre Struktur, so verschieden ihre Wirkmecha­nismen: Sie können die Integrität der Zellmembran stören, die DNA, RNA oder Protein­synthese inhibieren, die Quervernetzung von Zellwandpolymeren unterbinden, die Funktion von Chaperonen blockieren sowie Mitochondrien zerstören. Die Antimicrobial Peptide Database (http://aps.unmc.edu/AP/main.php) verfügt derzeit über 2253 Einträge zu AMPs aus verschiedenen ­Organismen.

Das für uns interessante Antifungal­protein AFP besteht aus 51 Aminosäuren. Fünf antiparallele β-Sheets, stabilisiert durch vier Disulfidbrücken, formen eine fassartige Struktur, die so genannte β-Barrel-Topologie. Diese tertiäre Struktur verleiht dem AFP eine außergewöhnliche Resistenz gegenüber hohen Temperaturen und Proteasen. Eine positive Nettoladung wird durch zwölf ­Lysine gewährleistet, die zur Ausbildung einer kationische Domäne an der Ober­fläche des Proteins beitragen (K9, K10, K32). Durch eine benachbarte hydrophobe Domäne (Y29, Y30, Y45, Y50) erhält das Protein seinen amphipathischen Charakter (Abb. 2). Das AFP ist für uns von beson­derem Interesse, da sein Wirkspektrum ausschließlich auf Hyphenpilze beschränkt ist, darunter so bedeutende landwirtschaftliche Schädlinge wie Fusarien (Abb. 3) und human­pathogene Aspergillen. In unseren bisherigen Untersuchungen zeigten sich Hefen, Bakterien und Pflanzen resistent gegenüber AFP, selbst in Säugerzellen zeigen sich weder zytotoxische noch immunogene ­Effekte des Proteins [2].

Survive or not to survive

Abb. 3 Protektive Wirkung des AFP auf Tomatenpflanzen, die mit dem Schädling Fusarium oxyspo­rum infiziert wurden. Die Wurzeln von Tomatenpflanzen wurden für zehn Tage in Nährmedium mit 100 µg/ml AFP (rechtes Bild) oder ohne AFP (linkes Bild) inkubiert. Danach wurden die Medien mit AFP-freien Nährmedien ausgetauscht, welche jedoch mit Sporen von F. oxysporum versetzt wurden. Nach weiteren zehn Tagen Inkubation zeigte sich eindeutig, dass eine Vorinkubation der Pflanzen mit AFP vor einer Fusarien­infektion schützt [3].

Was unterscheidet AFP-sensitive von AFP-resistenten Organismen? A. niger ist ein AFP-sensitiver Pilz. Bei einer minimalen Hemmkonzentration von nur 1 µg/ml treten zuerst apikale und subapikale Verzweigungen auf – der Pilz versucht, die Hemmung des polaren Wachstums durch Neubildung von Hyphenspitzen zu umgehen. Trotzdem: Die Hyphenspitzen schwellen an, um schließlich zu platzen [5]. A. niger hat den Kampf gegen das AFP verloren. Elektronenmikroskopische und immunofluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass AFP bei sensitiven Pilzen hauptsächlich an die Zellwand bindet und zu einem geringen Teil an die Plasmamembran. Es kommt zu Membranver- änderungen in Form von Einstülpungen, bis sie schließendlich perme­abilisiert wird. Bei resistenten Pilzen wurde AFP dagegen im Zellinneren lokalisiert [3, 4]. Wir konnten Chitin sowie die Chitinbiosynthese als potenzielle zelluläre Targets von AFP ausmachen [5]. Chitin, ein Polymer aus β-1,4-verlinkten N-Acetyl- glucosaminen, stellt bei Hyphenpilzen einen Anteil von bis zu 30% der Zellwandtrockenmasse dar. Bei resis­tenten Hefen sind dies nur 1– 2%, Bakterien, Pflanzen und Säugerzellen enthalten gar kein Chitin. Dies wäre eine Erklärung, warum das AFP spezifisch für Hyphenpilze ist.

Der Mechanismus der Chitinbiosynthese in Hyphenpilzen ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Generell geht man davon aus, dass zymogene Chitinsynthasen mithilfe spezialisierter Mikrovesikel, den Chitosomen, zur Hyphenspitze transportiert und dort erst proteolytisch aktiviert und in der Plas­ma­­membran verankert werden. Nach der Akti­vierung katalysieren sie die Poly­me­ri­sation von N-Acetylglucosamin zum β-1,4-verknüpften Homopolymer Chitin. Die Chitinmoleküle werden daraufhin über die Plasmamembran transloziert, verbinden sich zu Mikrofibrillen und assoziieren mit weiteren Komponenten der Zellwand. Hyphen­pilze verfügen über Chitin­synthasen der Klassen I – VII, dabei sind die Chitinsynthase III, V und VI und VII spezifisch für Hyphen­pilze, während Hefen nur über die Klassen I, II und IV verfügen. Chitinsynthasen der Klasse III und V sind insbesondere deshalb interessant, da sie essen­ziell für das Aufrecht­erhalten des polaren Wachstums in Hy­phen­­pilzen, und für die Virulenz gegenüber Pflanzen und Säuger­zellen sind und mög­licherweise spezifische Targets von AFP sein könnten. Werden sensitive Hyphenpilze mit AFP konfrontiert, bei denen die Chitin­synthase III deletiert wurde, zeigt sich eine starke Vermin­derung der Suszeptibilität gegenüber dem Wildtyp – also ein deutlicher Hinweis auf eine Bedeutung der Chitin­synthase im Zusammenhang mit der Abwehr gegenüber AFP [5].

Alles eine Frage der richtigen Antwort

Abb. 4 Die Antwort von S. cerevisiae auf die Konfrontation mit AFP. Die richtige Antwort auf eine Konfrontation mit AFP ist die Hochregulierung von Chitinsynthase-Genen. In betrachteten Mutanten wird eine Reihe von ­Signalkaskaden aktiviert (rot), die in ihrem Zusammenspiel zur Erhöhung des Chitin Gehaltes in der Zellwand führen.

Warum sind nun aber einige Hyphenpilze AFP-sensitiv und andere AFP-resistent? Prinzipiell liegen einer Resistenz gegenüber einem beliebigen AMP zwei unterschiedlichen Möglichkeiten zu Grunde. Entweder fehlen dem resistenten Organismus das bzw. die AMP Target(s) oder er verfügt über eine erfolgreiche Verteidigungs­strategie. Verteidigungsstrategien gegenüber AMPs sind z. B. das Maskieren der Oberfläche durch einen Umbau der Zelloberfläche, das extrazelluläre Abfangen des AMP durch spezielle Oberflächenstrukturen, eine Expression spezifischer Proteasen oder auch die Modifikation der intrazellulären Targets. Voraussetzung solcher Verteidigungsstra­tegien sind Signalkaskaden, die es der Zelle ermöglichen, die Anwesenheit des AMP zu erfassen, dies als Stresssignal zu interpretieren und intrazellulär weiterzuleiten, sodass daraufhin das zelleigene Verteidigungs­system aktiviert wird.

Wie ist das nun im Falle des AFPs? Durch eine Interaktion des AFPs mit Chitin bzw. der Chitinbiosynthese wird Zellwand­stress auf den sensitiven Pilz ausgeübt und die Integrität der Zellwand gestört. Zellwandstress löst in Hefen und Hyphenpilzen den so genannten „Cell Wall Integrity (CWI) Pathway“ als Antwort aus. In der Folge wird der Transkriptionsfaktor RlmA aktiviert und induziert die Expression der a-1,3-Glucansynthase, um den Anteil an Glukanen in der Zellwand zu erhöhen [6]. Diese Antwort wird bei einer Konfrontation von A. niger mit AFP beobachtet [7]. Nun zählt A. niger aber zu den AFP-sensitiven Pilzen. Wieso also führt die Aktivierung dieser Verteidigungsstrategie mit dem Ziel, die Inte­grität der Zellwand wiederher­zustellen, ins Leere? Ist dies mög­licherweise die falsche bzw. eine nicht ausreichende Antwort? Um dieser Frage nachzugehen, haben wir uns die Reaktion eines resis­tenten Pilzes, der Hefe Saccharomyces ­cerevisiae, auf das AFP angeschaut. Unser Gedankengang: Kann ein AFP-resistenter Pilz AFP-sensitiv werden, wenn seine Verteidigungsstrategien ausge­hebelt werden? Wenn ja, dann können wir aus diesen Experimente Rückschlüsse für die über­lebenswichtigen Antworten bzgl. des AFPs ziehen. Dazu haben wir aus einer genomischen Deletionsbank von S. cerevisiae 100 Mutanten ausgewählt, die spezifisch Defekte in der Zellwand oder Zellmem­bran­integrität aufwiesen bzw. bei denen verschiedene Signalkaskaden – u. a. der ­CWI-Weg – gestört waren. Von den 100 unter­suchten Mutanten wurden 35 tatsächlich AFP-sensitiv. Neben zellulären Prozessen (Chitinsynthese, Endocytose) betrafen diese Mutationen verschiedene Signalwege (CWI Weg, Calcium Signalkaskade, TOR Signalkaskade, cAMP-PKA Signal­kaskade; [8]). Das Interessante hierbei: Sowohl der Wildtyp als auch die Mutanten von S. cerevisiae reagieren mit einer verstärkten Chitinsynthese auf die Anwesenheit von AFP (Abb. 4), aber nicht mit einer verstärkten Glukansynthese. Und dies scheint den entscheidenden Unterschied zu A. niger und anderen AFP-sensitiven Hyphenpilzen zu machen. Diese reagieren auf die Anwesenheit von AFP mit einer Verstärkung der Glukansynthese (Abb. 5) [8]. Offensichtlich die falsche Antwort. Eine Konfrontation mit AFP wird somit von Pilzen unterschiedlich interpretiert. Während einige versuchen, den Zellwandstress zu umgehen, indem sie den Anteil an Glukanen in der Zellwand erhöhen, setzen andere auf die Chitinbiosynthese. Nur Letztere setzen jedoch auf das richtige Pferd. Die Verteidigungsstrategie wird somit zu einem wichtigen Parameter bei der Bestimmung der Suszeptibilität gegenüber AFP.

Was wir daraus lernen können

Abb. 5 Die Antwort von A. niger auf die Konfrontation mit AFP. Der CWI Weg (rot) wird aktiviert und es kommt zu einer erhöhten Produktion von Zellwandglukanen. Leider die falsche Antwort, da der Chitingehalt nicht hochreguliert wird. A. niger bleibt sensitiv und wird bereits von geringen AFP-Konzentra­tionen abgetötet.

Wenn wir unsere Erkenntnisse bezüglich des AFP auf eine generelle Interaktion zwischen Mikroorganismen und AMPs übertragen, können wir schlussfolgern: Ob ein Organis­mus resistent oder sensitiv im Hinblick auf einen Wirkstoff ist, hängt nicht nur von der Anwesenheit des Targets ab oder der Konzentration des Inhibitors, sondern im erheblichen Maß von der Verteidigungsstrategie des attackierten Organismus. Wird eine adäquate Antwort gewählt, so überlebt der ­Mikroorganismus. Ist die Antwort zu schwach oder falsch, wird er beschädigt oder ab­getötet. Dies bedeutet, dass der Erfolg zukünftiger Wirkstoffanwendungen auch davon abhängt, ob kluge Kombinationen verschiedener Substanzen gewählt werden. So kann eine Substanz ein spezifisches ­Target angreifen, eine oder weitere Substanzen sollten die Verteidigungsstrategie aushebeln. Nur so hat Goliath eine Chance.

Literatur:
[1] Armed and Dangerous. (2010), Science Vol. 327 no. 5967 pp., 804 – 805
[2] Meyer V. (2008), Appl Microbiol Biotechnol.78(1),17 – 28
[3] Theis T, Marx F, Salvenmoser W, Stahl U, Meyer V. (2005), Res Microbiol.156(1),47  – 56
[4] Theis T, Wedde M, Meyer V, Stahl U. (2003), Antimicrob Agents Chemother.47(2),588  – 93
[5] Hagen S, Marx F, Ram AF, Meyer V. (2007), Appl ­Environ Microbiol. 73(7), 2128  – 34
[6] Damveld RA, Arentshorst M, Franken A, vanKuyk PA, Klis FM, van den Hondel CA, Ram AF. (2005), Mol ­Microbiol. 58(1),305  – 19.
[7] Meyer V, Damveld RA, Arentshorst M, Stahl U, van den Hondel CA, Ram AF. (2007), J Biol Chem. 282(45), 32935  – 48
[8] Ouedraogo JP, Hagen S, Spielvogel A, Engelhardt S, ­Meyer V. (2011), J Biol Chem. 286(16),13859-68

Erstveröffentlichung: Müller-Hagen, D., Meyer, V., labor&more, 6.2013.

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    Vera Meyer, geb. 1970, studierte Biotechnologie an der Universität ­Sofia und der Technischen Universität Berlin, wo sie 2001 promovierte. Nach Forschungs- aufenthalten am Imperial College London und der Universität Leiden habilitierte sie 2008 an der Technischen Universität Berlin. Von 200 ... mehr

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